【摘 要】
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p53失活是肺癌治疗无效和耐药性产生的常见诱因,使得基于重构p53抗癌功能作为肺癌治疗策略成为可能。但研究发现基于重构p53抗癌功能的治疗策略在细胞水平研究非常有效,但在人体或动物水平收效甚微,原因是p53抗癌功能不能有效的被激活。p53抗癌功能与其磷酸化位点有关,之前研究结果表明S15位点的磷酸化在p53抗癌功能中发挥重要作用,我们研究发现S392位点的磷酸化与重构p53抗癌功能密切相关。这两个
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p53失活是肺癌治疗无效和耐药性产生的常见诱因,使得基于重构p53抗癌功能作为肺癌治疗策略成为可能。但研究发现基于重构p53抗癌功能的治疗策略在细胞水平研究非常有效,但在人体或动物水平收效甚微,原因是p53抗癌功能不能有效的被激活。p53抗癌功能与其磷酸化位点有关,之前研究结果表明S15位点的磷酸化在p53抗癌功能中发挥重要作用,我们研究发现S392位点的磷酸化与重构p53抗癌功能密切相关。这两个磷酸化位点在重构p53抗癌功能的具体作用以及二者之间是否存在相互影响尚不明确,因此本课题拟深入研究p53磷酸化位点S15和S392在非小细胞肺癌重构p53抗癌功能的作用,具体研究内容如下:1.本文首先直接合成p53基因、p53(S15A)基因、p53(S392A)基因和p53(S15A-S392A)基因,然后将目的基因与p HBAD-EF1-MCS-CMV-GFP载体进行重组,其产物转化细菌感受态细胞,进行平板挑菌,对长出的克隆菌落做PCR鉴定。并对转化成功的阳性克隆菌液送测序公司测序,测序结果显示载体构建成功,随后将构建的载体质粒包装成腺病毒用于后续研究。将构建的腺病毒感染p53-null NCI-H1299细胞24小时后,可见绿色荧光产生,表明病毒载体转染进入了NCI-H1299细胞,随后通过蛋白免疫印迹实验证实构建的表达载体可以成功表达目的基因。以上实验结果说明成功构建了p53和p53磷酸化位点突变的腺病毒表达载体,为研究p53磷酸化位点在非小细胞肺癌重构p53抗癌功能的作用提供前期基础。2.其次通过p-p53(S15)和p-p53(S392)位点激活剂激活p53磷酸化位点检测p53磷酸化位点S15和S392对NSCLC细胞的增殖抑制作用,结果显示S15和S392位点磷酸化能够有效激活p53肿瘤抑制功能;然后通过Hoechst染色、AIF免疫荧光染色、亚细胞分布等方法确定p53位点S15磷酸化对NSCLC细胞的增殖抑制作用的方式不是通过诱导细胞凋亡;最后通过流式细胞术检测细胞周期,研究结果表明p53位点S15磷酸化和S392磷酸化通过阻滞细胞周期来抑制细胞增殖。3.最后检测了p53两个磷酸化位点S15和S392之间的相互作用。结果表明用两个位点激活剂同时处理细胞,细胞的增殖抑制作用与单独使用一个位点激活剂相比差异不显著。蛋白质免疫印迹结果表明当Nutlin-3加入NCI-H1299和NCI-H460细胞中,在激活p53位点S15磷酸化时,同时激活了p53位点S392磷酸化,说明两个位点磷酸化是相互作用的。总之,本文初步研究了p53磷酸化位点S15和S392对NSCLC细胞的增殖抑制作用及潜在作用机制,明确了两个位点之间的相互作用关系,为重构p53抗癌功能提供了理论支持和数据参考。
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