基于聚电解质球刷的组装结构设计及其在生物检测中的应用研究

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快速灵敏的生物检测技术对于疾病诊断和检测有着重要的意义。在现有的检测体系中主要涉及两类关键材料:一是对生物分子进行识别、捕获、控制和运输的载体材料;二是对捕获到的生物分子进行检测的信号标记材料。近年来,作为一类新型的载体,磁性微球因其在外磁场的作用下能够方便地实现全自动检测而被广泛应用于生物分离的平台。然而目前磁性微球作为载体时,存在蛋白荷载量偏低且生物活性不高等问题。针对这一问题,本文提出一种新型的Brushed Beads-on-Beads结构的主客体微球(BBBs),首先采用四氧化三铁/聚苯乙烯磁性微球作为母球,采用聚丙烯酸球刷作为子球,通过共价组装法制备得到具有丰富的多级结构、独特的三维空间和外层为柔软高分子链段表面的新型载体微球,以同时实现高蛋白荷载量、高生物活性与检测自动化的目标。其次采用扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)、动态光散射(DLS)和电导滴定等手段对微球的形貌结构、理化参数等进行系统全面的表征。最后将磁性母球(MPs)作为对照球,将链霉亲和素(SA)作为模式蛋白分别偶联在BBBs与MPs微球上,并将微球-SA复合物结合不同尺寸的生物分子,来评估SA在偶联后的活性变化。结果表明,BBBs微球有效表面积更大,单个颗粒上SA的荷载量是MPs的3倍。捕获免疫复合物时,BBBs微球表面上单位SA结合免疫复合物的能力为MPs的6.7倍,这些结果均显示了主客体微球在捕获目标物和高性能生物检测领域的巨大应用潜力。针对生物检测所用的信号标记材料,在检测过程中能够保持较高的稳定性,同时具有一定信号放大的能力来实现对靶分子的高灵敏检测一直是备受关注的研究热点。本文在成功制备高性能的BBBs载体微球的基础上,同样利用这一新型材料,制备了一种高亮的荧光信号放大结构单元,以期使其生物检测过程中实现高灵敏的信号放大功效。首先,利用球刷独特的三维空间和Donnan效应使5-氨基荧光素(5-AF)富集在球刷内部,并用化学共价结合的方法使荧光分子稳定地固载在球刷中,用荧光分光光度计测试与探究5-AF的偶联量与产物光强之间的关系,然后考察了荧光标记球刷在不同p H和盐浓度条件下的光强变化,并用参比法测定不同荧光分子偶联量球刷的荧光量子产率,探究量子产率与偶联量之间的关系。最后选择SA作为模式蛋白,通过EDC/NHS方法将其固定在荧光标记球刷上后,用生物素的结合量来表征偶联在球刷上SA的生物活性。研究表明,通过调节荧光分子的添加量可以制备得到不同荧光强度的荧光标记球刷,且荧光量子产率与偶联量之间存在着非线性的变化关系,将SA偶联在荧光标记球刷上后发现SA仍然保持了一定的生物活性,证实了荧光标记球刷在生物检测中应用的可行性。
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