背景和目的毛囊不但是人体内最小的器官,同时也是人体内极少数几个能够终生维持周期性循环生长的器官之一,即出生后的毛囊依然能够重复毛囊的形态发生过程进行周期性的生长。很多因素可破坏毛囊而引起脱发,雄激素源性脱发(Androgentic Alopecia, AGA)是一种最常见的脱发病,主要表现为脱发区毛囊微型化和毛囊固有周期的改变。AGA虽然不属于严重疾病,但会给病人带来很大的社交困扰和精神痛苦。目前,治疗AGA的主要方法有两种,一种是药物治疗——米诺地尔和非那雄胺,仅仅是暂时阻止脱发,停药后继续脱发；另外一种是毛发移植术,也仅仅是“拆东墙补西墙”的做法,并不能增加实际的毛发数量,对于大面积秃发者还存在供区不足的问题,此外供区瘢痕、移植成活率不稳定和手术效率极其低下等问题也明显影响了手术效果。近年来,随着组织工程技术的发展,构建出组织工程毛囊成为修复大面积脱发的一种理想选择。构建组织工程毛囊的前提是获取足够多具有生物学功能的种子细胞,即毛乳头细胞(dermal papilla cell, DPC)和毛囊干细胞。毛囊由上皮成分(包括毛囊干细胞、毛母质、内外根鞘)和真皮成分(包括毛乳头、结缔组织鞘)组成,毛囊在胚胎时期的形态发生、出生后的周期循环和毛囊的重建均离不开DPC和毛囊干细胞间的相互作用。其中,DPC在毛囊周期循环和毛囊再生／重建中均具有关键作用。因此,对DPC的研究是构建组织工程毛囊的关键。毛乳头主要由DPC构成,该细胞是高度特异的成纤维细胞,但与成纤维细胞在生长方式、生物合成及生物学功能上却有着本质的差别。DPC最明显的特征是具有凝集性生长的特性：其次,DPC还能分泌多种生长因子、细胞因子、生物活性蛋白及特殊的细胞基底膜成分,参与毛囊生长周期的调控；最后,DPC在传代培养后仍保留有诱导毛囊再生和毛发生长的能力,且这种能力与DPC的生长特性密切相关。然而,目前我们尚不清楚：随着传代次数的增加DPC的生物学特性和生物学功能逐渐丧失的真正原因。因此,建立DPC的体外拟生态培养模型,培养出拟生态的人工毛乳头,不仅有助于详尽地了解DPC的生物学特性和生物学功能,同时也为组织工程毛囊的构建提供足够的具有生物学功能的种子细胞。鉴于毛乳头的特殊性,我们提出构建出的拟生态人工毛乳头(artificial dermal papilla,ADP)必须满足一下几个条件：①细胞呈球形聚集状生长,从外形上类似于毛乳头；②大小类似于正常毛乳头,直径介于200-300μm;③ADP内的细胞状态稳定,具有较低的细胞增殖率和凋亡率；④表达正常DPC所特有的细胞标记物Versican、ALP和α-SMA;⑤具有正常DPC所具有的诱导毛囊形成的生物学功能。目前,虽然已经多为学者在体外构建出了DPC成球形生长的细胞培养模型,但在这些模型中所培养出的DPC球仅仅能满足上述部分标准,不是拟生态的ADP,因此他们所采用的培养方法也并非DPC的拟生态培养模型。由于体内的毛乳头被富含由纤维连接蛋白、层粘连蛋白、Ⅳ型胶原和蛋白聚糖等组成的基底膜所包裹,这些细胞外基质为DPC的生长提供了丰富的营养成分。我们据此猜测,如果将DPC接种由上述细胞外基质成分所包被的培养板表面进行培养时或许能够构建出DPC的拟生态培养模型。因此,基于在体外构建出模拟DPC体内生长环境的拟生态培养模型这一研究目的,本实验的研究内容主要包括两部分：1、DPC体外拟生态培养模型的构建2、DPC体外拟生态培养模型的评价研究方法1毛乳头体外拟生态培养模型的构建分别采用显微解剖法和酶消化法进行毛乳头的分离和培养,计算分离相同数量的毛囊时,各自获得的毛乳头数量和耗费时间；显微镜下观察毛乳头的贴壁、细胞迁出和生长情况；通过MTT法比较2组细胞的生长活性；通过细胞免疫荧光方法观察2组细胞中a-SMA蛋白的表达情况。将分离的毛乳头随机接种于已被Matrigel、透明质酸钠凝胶、Ⅳ型胶原、纤粘连蛋白和层粘连蛋白包被的培养板中,观察毛乳头贴壁和迁出情况。将第4代DPC随机接种于已分别被Matrigel、透明质酸钠凝胶、Ⅳ型胶原、纤粘连蛋白和层粘连蛋白包被的培养板中,MTT法比较各组细胞的增殖活性。将Matrigel分别依照200μl/cm2、150μl/cm2和50μl/cm2标准接种于培养板,将第4代DPC接种后观察细胞生长情况;分别在Matrigel铺板后0min及37℃的CO2孵箱中放置15min、30min和60min后再进行第4代DPC的接种,观察细胞生长情况；依照Matrigel与DPC的接种次序不同,将实验分为3组,即：A组(先接种DPC,待细胞贴壁后再接种Matrigel)、B组(将Matrigel溶液与DPC混合制成DPC悬液再接种至培养板)、C组(先接种Matrigel,37℃放置60min后再接种DPC),观察细胞生长情况；依照150μL/cm2的标准接种Matrigel于培养板,再分别依照2×104、1×104、0.5×104和0.25×104的标准接种DPC,观察细胞生长情况；分别将第4代和第10代DPC接种于已被Matrigel(接种标准为150μL/cm2,放置时间为30min)包被的培养板中。观察实验各组中DPC的生长状态,计算DPC团的直径和数量。2毛乳头细胞体外拟生态培养模型的评价生物学特性的评价：将在Matrigel上接种的DPC连续培养5d,显微镜下观察细胞团直径的变化情况。同时分别采用RT-PCR法检测DPC中Versican、ALP、 α-SMA和β-catenin基因的表达情况；免疫荧光法检测细胞内Ki67、TUNEL、 Versican、ALP、α-SMA和β-catenin蛋白的表达情况；免疫印迹法检测DPC中Versican、ALP、α-SMA和β-catenin蛋白的表达情况生物学功能的评价：将第4代DPC、第3代毛母质细胞和Matrigel依照接种次序的不同,将实验分为A组(Matrigel、DPC+毛母质细胞)、B组(Matrigel、 DPC、毛母质细胞)两个实验组和对照C组(Matrigel、毛母质细胞)。将各组培养板置入CO2的培养箱中,每2天换液1次,所更换的培养基为完全培养基和间充质干细胞培养基各一半,连续观察10d。结果1毛乳头细胞体外拟生态培养模型的构建同显微解剖法相比,酶消化法不但具有更高的分离效率和收获率,同时也有利于毛乳头的贴壁和细胞的迁出。两种方法所获得的DPC在细胞形态、生长方式和细胞活性方面均无显著性差异,同时也均表达α-SMA。Ⅳ型胶原、纤粘连蛋白和层粘连蛋白三组中细胞形态和生长方式均类似于对照组；透明质酸钠组中的DPC未见贴壁和生长；Matrigel基质胶组中的DPC在接种后可在培养孔的中央贴壁生长,但在培养孔边缘的细胞则相互聚集成团状生长。Matrigel的接种量在200μl/cm2、150μl/cm2和50μl/cm2条件下,三组均可观察到ADP的形成。在50μl/cm2组中,DPC在培养孔中心部位呈贴壁状生长,仅仅可在培养孔边缘见到少量ADP,且ADP直径也较小,多数小于180μm；在200μl/cm2和150μl/cm2两组中的孔边缘和中央均可见到大量ADP,直径介于(180-320)μm,近似于体内正常毛乳头直径,200μl/cm2和150μl/cm2组间无显著性差异(P=0.0087)。在Matrigel包被培养板后的Omin、15min、30min和60min时接种DPC,4组中均可见到形成的DPC细胞球,ADP的数量和直径随着Matrigel基质胶接种时间的不同而变化。0min组和15min组中ADP的数量最多,绝大部分ADP直径小于100μm,仅有部分ADP直径介于(100-180)μm;30min和60min两组中的ADP数量较前两组少,但细胞团直径较大,绝大部分介于(180-320)μm。在Matrigel与DPC接种次序的实验中,A组(DPC,待细胞贴壁后再接种Matrigel)中的DPC呈贴壁状生长,几乎见不到ADP的形成；B组(将Matrigel溶液与DPC混合制成DPC悬液再接种至培养板)和C组(先接种Matrigel,37℃放置60min后再接种DPC)均可观察到ADP的形成,同B组相比,C组中ADP的直径类似于自然毛乳头直径,介于(180-320)μm。当细胞接种量为2×104时,在培养板中几乎见不到聚集成球形或类球形的ADP,细胞以不规则的方式聚集；在接种量为1×104、0.5×104和0.25×104的3组中均可见到ADP的形成,ADP的数量随着细胞接种量的减少而增加,但ADP的直径随着所接种细胞接种量的增加而增加；细胞接种量在0.5×104和0.25×104时,所形成ADP的数量最多,绝大部分ADP直径小于100μm,仅有部分细胞团直径介于(100-180)μm；细胞接种量在1×104时,所形成ADP的数量最少,但直径较大,绝大部分介于(180-320)μm。当将第四代和P第八代DPC接种于Matrigel时,2组中均可见到大量DPC细胞团的形成；ADP直径相似,大部分介于(180-320)μm。2毛乳头细胞体外拟生态培养模型的评价DPC在Matrigel表面接种6h后即可观察到细胞聚集成团状进行生长的情况,此时的ADP直径多为小于100μm。在接种后的前48h内,随着培养时间的延长,ADP的体积逐渐增加,直径可由达到(180-320)μm。但随着培养时间的进一步延长,在显微镜下观察不出ADP直径的明显变化。ADP内的细胞仅观察到极少量Ki67和TUNEL的表达；当将ADP重新接种于培养板后,ADP内细胞仍可迁出生长。RT-PCR、细胞免疫荧光和蛋白免疫印迹实验结果均显示：对于第四代DPC而言,在Matrigel中三维培养形成ADP后,ADP内DPC在Versican、ALP、α-SMA和β-catenin的表达水平同二维培养条件下的表达水平相似；对于第八代DPC而言,在Matrigel中三维培养形成ADP后,ADP内DPC在Versican、ALP、α-SMA和β-catenin的表达水平远远高于二维培养条件下的表达,类似于第四代DPC的表达量。虽然成纤维细胞在Matrigel表面也能聚集形成细胞团,但却不表达上述标记物。当将DPC和毛母质细胞混合接种后,仅当先将DPC接种于Matrigel上形成ADP后再接种毛母质细胞时,才可观察到毛母质细胞分化为毛干。结论1同显微解剖法相比,酶消化具有提高毛乳头分离效率、降低劳动强度、提高毛乳头收获率、提高毛乳头贴壁率和细胞迁出率的优点,后期实验均采用酶消化分离毛乳头。2同Ⅳ型胶原、纤粘连蛋白和层粘连蛋白3种细胞外基质相比,Matrigel有利于DPC聚集成细胞球状生长,其最佳接种条件时：Matrigel依照150μl/cm2的接种量,37℃放置30min后,DPC接种密度为1×104。依照上述标准接种时,所形成的类似于体内正常毛乳头的ADP数量最多。3在Matrigel上所形成的ADP,在接种的前6h内主要是通过细胞间的相互粘附而聚集成球,之后主要是通过细胞增殖而增加细胞球直径。ADP直径的增加主要发生在培养的前48h；虽然随着培养时间的延长,ADP直径几乎不再发生变化,但ADP内细胞基本处于一种不增值也不凋亡的稳定状态；ADP内DPC可在二次接种后再次迁出,类似于体内正常毛乳头的生物学特性。4RT-PCR、细胞免疫荧光和蛋白免疫印迹实验结果均表明：在Matrigel表面所形成的ADP,不但可以维持,同时也可以恢复细胞内Versican、ALP、α-SMA和β-catenin的表达,说明在Matrigel表面培养所形成的ADP可维持DPC本身所特有的生物学特性。5在Matrigel表面接种DPC和毛母质细胞时,可观察到毛母质细胞分化成为毛干,说明在Matrigel表面培养的ADP具有生物学功能,,同时Matrigel也可作为毛囊体外重建的模型。6同体内正常毛乳头相比,在Matrigel构建的拟生态培养模型中所形成的ADP,不但在细胞生长方式、细胞团直径、细胞生物学特性方面相似,即便在细胞特有标记物表达和细胞生物学特性方面也均相似,是一种拟生态的ADP。