抗生素作为一种用于治疗细菌疾病的药物,自被发现以来在医疗等领域做出了重大贡献,但全球过度使用或滥用抗生素,导致耐药微生物正在成为传统抗生素产业的死敌。目前多个国家已限制甚至禁止了部分抗生素的使用,并积极开发新型抗生素或抗生素替代品。自然界生物体为了抵御外来病原体释放出具有抗菌活性的小分子肽物质被称为抗菌肽,抗菌肽由于来源天然,不会造成环境污染且不易产生耐药性,成为了传统抗生素的理想替代品。目前已有越来越多的抗菌肽被发现或制备出来,并应用到医药、食品和化妆品领域中。本文以大豆粕为研究对象,结合生物发酵和乙醇分离法制备富集大豆抗菌肽,在明确其抗菌特性及结构信息基础上,初步探究大豆抗菌液的抗菌作用机制,为工业制备大豆抗菌肽提供理论数据和方法指导。本文以大豆粕为原料,米曲霉为发酵菌种,采用微生物发酵法制备大豆粕抗菌液,主要选用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌,以抗菌能力为主要指标优化大豆粕发酵条件。结果表明液态发酵法更适用于制备大豆粕抗菌液,最优发酵条件为:料液比1:9、初始发酵p H 4.5、米曲霉添加量为0.7‰、葡萄糖添加量2.5%,在37℃下恒温发酵42 h,各因素对大豆粕发酵液的抗菌能力影响大小依次为发酵温度>料液比>米曲霉添加量>发酵时间>初始发酵p H>葡萄糖添加量;在此基础上获得大豆粕抗菌液的抗菌率变化曲线,结果显示浓度为60 mg/m L的大豆粕抗菌液对于大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为52.06%和40.89%,表明大豆粕抗菌液是一种良好的潜在抗生素替代品。选择不同浓度乙醇溶液对大豆粕抗菌液进行分级分离,并系统研究了分离组分中理化性质与其抗菌活性之间的内因关系。结果显示,80%乙醇溶液分离上清液组分H-4-Q的抗菌效果最佳,当其浓度为60 mg/m L时,对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抗菌率分别达到69.98%和54.11%,较同等浓度大豆粕抗菌液的抗菌活性分别提高了34.42%和32.33%,表明乙醇分级能显著富集抗菌活性成分。经成分分析发现,H-4-Q的总氮含量最高,占原发酵液的33.87%,而总糖含量最低;肽分子量分布结果显示H-4-Q的肽分子量较其他组分更低,其中1-3 k Da和<1 k Da肽段占比分别为40.02%和29.47%;H-4-Q总氨基酸组成中碱性氨基酸比例最高;采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS从H-4-Q中鉴定出65条抗菌肽。根据抗菌肽作用靶点的不同,分别检测了H-4-Q对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞壁、细胞膜以及胞内磷代谢活动的影响。结果显示,经H-4-Q处理后,两种细菌的细胞壁均被破坏,通透性增加,大肠杆菌与金黄色葡萄球菌实验组的碱性磷酸酶活性较对照组分别提高了4.12倍和3.84倍;经处理的两种细菌培养液的电导率也明显升高,且添加H-4-Q的浓度越高,电导率增加越大,位于胞内的β-半乳糖聚酶活性也明显上升,大肠杆菌与金黄色葡萄球菌培养液的β-半乳糖苷酶的活性最高分别为39.60 U和34.88 U,表明细胞膜也遭到一定程度的破坏;磷代谢的结果表明H-4-Q能使两种细菌的磷代谢速度逐渐降低并最终停止,且大肠杆菌对于H-4-Q的作用更加敏感,在作用2 h内磷代谢速度已经明显降低,说明H-4-Q不仅能够作用于细菌的细胞壁、细胞膜,也能影响胞内磷代谢活动来抑制细菌生长繁殖。