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第一部分研究sublytic C5b-9上调RGC32基因表达对大鼠Thy-1肾炎肾小球系膜细胞(GMCs)增殖的影响目的:检查Thy-1肾炎(Thy-1 nephritis,Thy-1N)大鼠肾组织(体内)和体外用亚溶解型(sublytic)C5b-9复合物刺激的大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cells,GMCs)中补体应答基因32(response gene to complement 32,RGC32)基因的表达情况。并探讨RGC32基因表达在sublytic C5b-9诱导大鼠GMCs增殖中的作用。方法:复制大鼠Thy-1N模型,同时体外培养大鼠GMCs并给予sublytic C5b-9刺激,收集不同时间点的肾组织或GMCs蛋白,行western blot检查RGC32基因的表达水平。然后,构建大鼠RGC32真核表达质粒(p IRESII-EGFP/RGC32)和RGC32发夹状小干扰RNA(short hairpin RNA,sh RNA)表达质粒,将上述质粒分别转染大鼠GMCs。其中,RGC32 sh RNA(sh RGC32)转染GMCs后48h再给予sublytic C5b-9刺激10h,用western blot检查各组GMCs中RGC32蛋白和GMCs增殖(cyclin D2和PCNA)及ECM分泌指标(FN和collagen IV)的表达情况,并通过CCK8实验检测各组GMCs的数量变化。结果:Thy-1N大鼠肾组织和受sublytic C5b-9刺激的大鼠GMCs中,RGC32基因的表达明显上调,并在10h左右达到高峰。p IRESII-EGFP/RGC32转染大鼠G MCs后能显著上调RGC32蛋白的表达,且GMCs的某些增殖和ECM分泌蛋白的表达也明显增多。另CCK8实验发现,GMCs的数量显著增加,但sh RGC32质粒的转染又可明显降低由sublytic C5b-9刺激GMCs诱导RGC32基因的表达,且相关的增殖及ECM分泌蛋白的表达水平也明显下降,同时GMCs增殖的数量也显著降低。结论:在Thy-1N大鼠肾组织和受sublytic C5b-9刺激的大鼠GMCs中,RGC32基因的表达明显升高,且上调的RGC32能够促进大鼠GMCs的增殖病变。第二部分探讨sublytic C5b-9刺激GMCs上调MZF1促进RGC32基因表达和GMCs增殖的作用与机制目的:研究sublytic C5b-9刺激大鼠GMCs后诱导表达的髓锌指基因1(myeloid zinc finger gene1,MZF1)对RGC32基因转录的调控作用及其分子机制,并进一步探讨转录因子MZF1表达上调对sublytic C5b-9刺激诱导GMCs增殖的影响。方法:采用分子克隆技术,将大鼠RGC32基因启动子全长(-686~-1 nt)及其三个截短序列-486~-1 nt、-286~-1 nt和-86~-1 nt插入到荧光素酶报告基因载体p GL3-basic中,获得RGC32基因启动子全长p GL3-RGC32-FL及三个截短质粒p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3。将上述质粒与内参照质粒p RL-SV40共转染GMCs,再给予sublytic C5b-9刺激10h,测定各组荧光素酶活性。同时,应用生物信息学软件(TF search)预测RGC32基因启动子上相应转录因子的结合位点。复制大鼠Thy-1N模型,同时体外培养大鼠GMCs并给予sublytic C5b-9刺激,行western blot检查该转录因子在不同时间点的表达水平。同时,构建该转录因子的真核表达质粒和小干扰质粒,将其与RGC32基因启动子全长和各截短荧光素酶报告质粒共转染GMCs,再行荧光素酶活性测定,确定该转录因子能否调控RGC32基因的转录。之后,根据TF search的预测,设计针对该转录因子在RGC32基因启动子上结合位点的引物,通过染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)实验确证该转录因子在RGC32基因启动子上的结合位点。最后,将该转录因子的真核表达质粒和小干扰质粒分别转染大鼠GMCs,并给予sublytic C5b-9刺激10h,用western blot检查各组GMCs中RGC32、cyclin D2、PCNA、FN和collagen IV的表达情况。此外通过CCK8实验测各组GMCs的数量变化。结果:Sublytic C5b-9刺激大鼠GMCs后可显著增加RGC32基因启动子全长质粒p GL3-RGC32-FL及截短质粒p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2的荧光素酶活性,而p GL3-RGC32-3截短质粒荧光素酶活性则显著下降。提示,RGC32基因启动子-286~-86 nt区域存在调控RGC32表达的反应元件。TF search软件预测到此区域内存在MZF1的潜在结合位点。进一步Ch IP实验确证,在大鼠RGC32基因启动子的-286~-86 nt区域的确存在MZF1的结合位点。此外,Thy-1N大鼠肾组织和用sublytic C5b-9刺激的GMCs中,MZF1基因的表达明显上调,并在10h左右达到高峰。随后实验发现,在大鼠GMCs中过表达MZF1能显著增强RGC32基因启动子活性,并上调RGC32蛋白的表达,且上述GMCs增殖及ECM分泌的指标均明显上调,同时GMCs的数量也显著增加。不过,沉默MZF1基因后能明显抑制由sublytic C5b-9刺激GMCs诱导的RGC32基因启动子活性的增加,并下调了由sublytic C5b-9诱导的RGC32基因的表达及GMCs的增殖和ECM的分泌。结论:在Thy-1N大鼠肾组织和受sublytic C5b-9刺激的大鼠GMCs中,转录因子MZF1的表达明显升高,且诱导升高的MZF1能启动GMCs中RGC32的基因转录,进而促进了GMCs的增殖病变。