论文部分内容阅读
目的 糖尿病性黄斑水肿(DME)是严重损害视力的糖尿病视网膜并发症，发病率高达30％。传统认为糖尿病微血管病变导致的血管通透性增强是主要的发病机制。目前的治疗方法为局部激光治疗，但并不能主动减少血管渗漏。临床实验发现糖皮质激素能够主动减轻DME患者的黄斑水肿程度，但其治疗DME的机理并不能从微血管病变的角度解释。由于糖皮质激素具有确切的抗炎作用，能够下调炎症组织中细胞因子的表达，并且已经证明对炎症导致的黄斑水肿有确切疗效，由此我们得到启发，试图从某些炎症相关性细胞因子的表达方面认识DME的发病机理，为新的治疗和预防方法提供支持。 材料和方法 一、不同条件下视网膜毛细血管内皮细胞紧密连接蛋白的表达 1．细胞培养： 取新鲜牛眼，沿角巩膜缘剪开，去除眼前节和玻璃体，只保留后部眼杯。轻轻剥离视网膜，剪碎，0.25％胶原酶消化2小时，100μm滤网过滤后洗下滤网上组织，置DMEM培养基(内含15％胎牛血清，100U／mL青霉素，100μg／mL链霉素，2ng／ml碱性成纤维细胞生长因子，100ng/ml肝素)中培养，定期换液。免疫组化方法检测细胞中Ⅷ因子的表达，以此鉴定内皮细胞。 2．紧密连接蛋白在各种条件下表达水平变化的检测： Trizol方法提取细胞总RNA，分别检测内皮细胞在正常培养液，含20mmol／L2004届博十研究生毕业论文葡萄糖的培养液中培养1周和2周，含IL一6(100林g/L)、含IL一1(100林留L)、含PGEZ(50m留L)、含PGE:(1 00m留L)的培养液中培养1天—7种不同培养条件下，五种紧密连接蛋白20一l，20一2，20一3，claudin一2，oeCludin的基因转录情况。引物设计:20一120一l上游:5’gag gge gae cag atc ctc3’下游:5’aaa atg能t tet gat ata gaa ag3’20一2上游:5’aee aga tte tga agg tga aca3’20一2下游:5’ett etc aea tte aaa gtg get3’20一320一3上游:5，aac gac gtg ggc ato ttc 93，下游:5’atg cgg atg tag aag gag te3’oeeludinoeeludin上游:5’ctg gat cag gga ata tec ac3’下游:5’ete tte act tte tte tet ata 93’elaudin一2elaudin一2上游:5’aag gge ete tgg atg gag t3，下游:5’eea agg atg aag aag act cc3’按下列组成在o.sml PCR管中依次加入如下组分，制成20卜L反应体系。MgC12，25mMReverse TranscriPtion 10又bufferdNTP Mixture，1 omMReeombinationR」lasin Ribonuclease 11止ibitorAMV Reverse TranseriPtase(High Conc.)Downstream PrimerTotal RNA4林L2协L2协L0 .5林L15U0 .5卜g1拼gNuclease一FreeW血ter to a final volume of20件L逆转录反应:42aC，1 smin今95oC，smin今4oC，smin2004届博十研究生毕业论文PCR反应:按下列组成在0.5ml PCR管中依次加入如下组分，制成100林L反应体系。Flrst strand eDNA reaetiondNTP Mixture，1 omMMgC12，25mMPCR 1 oxbufferUPstream PrimerDownstream Primer几叮DNA pol帅erase2拼L1 .8抖L7 .5协L9 .8拼L50Pmol50Pmoll~2 .sunitsNuelease一Free认厄ter to a final volume of 1 00林L反应条件:94℃，3osec分55℃，3osee令72℃，lmin峥4oC30eycles3.糖尿病大鼠模型诱导:选取体重150一2009的健康成年雄性Wistar大鼠为实验对象。腹腔注射strePtozotocin50m留kg。定期测血糖。血糖12mmol/L以上或尿糖十+一+++者定义为糖尿病鼠。对照大鼠腹腔注射同等体积柠檬酸缓冲液。4.视网膜血管通透性检查:糖尿病鼠、眼内应用曲安奈德、以及眼内应用PKC抑制剂的大鼠，上腔静脉注射lm12%Evans蓝溶液，10分钟后取眼球，做视网膜铺片，于绿色荧光显微镜下观察Evans蓝在血管中的分布情况。5.视网膜组织免疫组化检查:糖尿病鼠、眼内应用曲安奈德、以及眼内应用PKC抑制剂的大鼠，分别做视网膜冰冻切片，免疫组化方法检测视网膜中TNFa、IL一l、IL一6、ICAM、COX一l、COX一2、vEGF、cPKcp的表达。视网膜铺片方法检测紧密连接蛋白occludin在糖尿病大鼠和正常大鼠视网膜血管的表达。2004届博十研究生毕业论文结果1.经培养得到的内皮细胞呈铺路石状单层生长，存在接触抑制。经免疫组化鉴定， 呈Vm因子阳性，阳性颗粒分布于细胞浆，证实为血管内皮细胞。2.高浓度葡萄糖作用下，内皮细胞20一l，20一2，20一3，elaudin一2，oeeludin的表达较正常 培养条件明显下调，并随时间延长，呈逐渐下降趋势。在IL一1作用下，五种紧 密连接蛋白的表达量均较正常明显下降。PGE作用下，zo一1、zo一3、claudin一2的 表达明显下降。zo一3、daudin一2受细胞培养条件的影响最为明显。3.在糖尿病诱导后3月，大鼠视网膜血管发生明显渗漏。眼内应用曲安奈德和PKC 抑制剂后，血管渗漏明显减轻。4.在糖尿病大鼠视网膜存在TNFa、IL一l、IL一6、ICAM、VEGF、COX一1、COX一2、 ePKCp的表达。糖皮质激素明显抑制TNFa、IL一1、IL一6、ICAM、COX一1、COX一2、 cPKcp的表达。PKc抑制剂明显抑制VEGF的表达。糖尿病大鼠视网膜血管壁 紧密连接