【摘 要】
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目的:检测肾小管上皮细胞上皮间质转化过程中Prkaa2和Rps6ka1的表达,探讨Prkaa2和Rps6ka1之间的关系及延缓肾纤维化进展的可行性。研究方法:1、使用重组蛋白TGF-β1诱导NRK-52e制备纤维化的细胞模型。采用qRT-PCR、Western blot、IF方法检测NRK-52e细胞和10ng/ml TGF-β1分别诱导12h、24h、36h的NRK-52e细胞的Prkaa2表达
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.81370772）；
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目的:检测肾小管上皮细胞上皮间质转化过程中Prkaa2和Rps6ka1的表达,探讨Prkaa2和Rps6ka1之间的关系及延缓肾纤维化进展的可行性。研究方法:1、使用重组蛋白TGF-β1诱导NRK-52e制备纤维化的细胞模型。采用qRT-PCR、Western blot、IF方法检测NRK-52e细胞和10ng/ml TGF-β1分别诱导12h、24h、36h的NRK-52e细胞的Prkaa2表达水平。2、构建Prkaa2低表达慢病毒载体,于NRK-52e贴壁生长达30%时加入,转染72h后收集细胞,qRT-PCR检测Prkaa2的敲减效率。设立TGF-β1诱导12h、Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导12h和空病毒+TGF-β1诱导12h三个实验组,正常的NRK-52e为对照组。通过Western blot检测Prkaa1、Prkaa2、纤维化相关蛋白α-SMA、E-cadherin、Vimentin和凋亡相关蛋白caspase9、Bax、p53的表达。3、从Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导12h组和Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导12h组中分别选取3个生物学重复样本,通过Affymetrix基因表达谱芯片测序结果筛选以上两组中差异表达的基因。并在TGF-β1诱导12h、Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导12h、Prkaa2空病毒加TGF-β1诱导12h三个实验组及正常的NRK-52e细胞中,通过qRT-PCR、Western blot、IF验证筛选出的差异基因的表达。结果:1、qRT-PCR、Western blot、IF结果显示:与对照组相比,TGF-β1诱导12h时Prkaa2的丰度上升,具有统计学意义（P<0.05）。2、Western blot结果显示:与对照组相比,TGF-β1诱导12h组Prkaa2、Bax、α-SMA、vimentin、caspase9和p53上调,具有统计学意义（P<0.05）,Prkaa1未见明显变化,E-cadherin下调,具有统计学意义（P<0.05）;。与空病毒TGF-β1诱导12h组比,Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导12h组E-cadherin上调,具有统计学意义（P<0.05）;Prkaa2、α-SMA、vimentin、Bax、caspase9和p53下调,具有统计学意义（P<0.05）,Prkaa1未见明显变化。3、通过Affymetrix基因表达谱芯片测序筛选出差异表达基因:Rps6ka1。Western blot和qRT-PCR验证结果提示与Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导12h组相比,Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导12h组Rps6ka1表达下调,具有统计学意义（P<0.05）。IF结果显示:与对照组相比,TGF-β1诱导12h组Prkaa2、Rps6ka1丰度上升;与空病毒+TGF-β1诱导12h组比,Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导12h组Prkaa2和Rps6ka1丰度下降。结论:Prkaa2在肾脏纤维化早期表达上调,促进纤维化的发展。Prkaa2与Rps6ka1存在正向调控关系,抑制Prkaa2/Rps6ka1途径可以改善TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化。
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