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背景:国家癌症中心发布的全国癌症统计数据显示,恶性肿瘤的发病率及死亡率均呈持续上升态势,死亡人数占全国死亡人数的23.91%,每年所产生的医疗费用超过2200亿元,癌症的治疗成为亟待解决的世界性难题。基因治疗作为一种新兴的抗肿瘤技术手段,通过基因转移技术将外源正常基因导入靶细胞,以修正基因缺陷,恢复其正常表达。但是,目前已知的抗肿瘤基因药物在生物体循环时不稳定,易被血液中的核酸酶降解,同时核酸分子易被血液循环系统的巨噬细胞清除,组织屏障穿透力以及靶点位置的选择性富集弱,因此构建高效、安全的基因传输载体,对于实现基因治疗药物的体内高效、稳定传输具有至关重要的意义。常见的基因传输载体主要分为两类,病毒基因载体及非病毒基因载体。病毒基因载体可以携带外源基因,能包装成感染性病毒颗粒,以介导外源基因转移和表达。但病毒基因载体存在严重的免疫原性,极大限制其在基因递送领域的应用。非病毒基因载体常用材料包含脂质体或脂类复合物、阳离子聚合物、壳聚糖载体、无机纳米粒子等。其中,聚乙烯亚胺凭借其独特的优势而受到了广泛关注,主要包括以下几点:第一,携带大量的正电荷可以组装带负电的基因药物形成稳定的纳米复合物,保护基因药物免受降解,同时有利于胞吞进入细胞;第二,聚乙烯亚胺含有大量的氨基,便于修饰改性,提高转染能力;第三,聚乙烯亚胺富含大量的正电荷,可以通过质子海绵效应实现内涵体逃逸,将基因药物释放到胞浆中发挥其功能。但是,聚乙烯亚胺仍然存在许多问题,譬如转染效率低、细胞毒性大等缺点。方法:针对上述问题,本研究首先用碳二亚胺化学法,以硫辛酸实现对低分子量聚乙烯亚胺(OEI1800)的修饰,构建一类具有良好生物相容性的硫辛酸修饰的聚乙烯亚胺衍生物,命名为LA-OEI。二硫键的引入,不仅能够实现还原力响应型基因释放,同时分子间的交联将提升载体的分子量和正电荷密度,进而极大提升载体的基因转染效率。以修饰后的LA-OEI材料为载体,实现抗肿瘤基因p53及miR-34a的递送。以人宫颈癌细胞系HeLa为模型,系统评价上述基因递送后肿瘤细胞增殖、迁移与侵袭的抑制效果与作用机制。同时,本研究利用Micheal加成反应将N-异丙基丙烯酰胺修饰到PEI25K上,成功构建了高效、低毒衍生物PEN,实现小核酸药物miR-29a的递送。以人非小细胞肺癌细胞系A549为模型,系统评价PEN介导miR-29a递送后的细胞增殖、迁移与侵袭效果及作用机制,探讨了该体系在恶性肿瘤基因治疗中潜能。结果:1.LA-OEI介导p53基因递送治疗宫颈癌的研究本研究首先以LA-OEI为载体进行pEGFP-N3和pGL-3质粒的递送,该载体展示出良好的基因转染效率。以HeLa细胞系(p53野生型)为模型,对LA-OEI/p53转染后的抗肿瘤作用效果与机制进行系统评价。荧光定量实时PCR和蛋白免疫印迹分析表明,载体LA-OEI介导p53基因递送后,在mRNA和蛋白水平均能够检测到p53表达水平的上调。MTT细胞增殖评价、Live/Dead细胞染色分析及细胞集落形成实验均表明,LA-OEI/p53转染能够显著抑制肿瘤细胞的增殖,其作用效果明显优于OEI/p53组。对肿瘤细胞增殖抑制机制的研究发现,该抑制效应与诱导细胞凋亡和细胞周期S期阻滞密切相关,同时细胞凋亡的诱导效应依赖于线粒体凋亡信号通络的激活。最后,细胞划痕愈合实验及Transwell侵袭实验分析表明,LA-OEI介导p53基因转染能够高效抑制肿瘤细胞的迁移与侵袭。2.LA-OEI介导小核酸miR-34a递送治疗宫颈癌的研究本研究以LA-OEI为载体进行miR-34a的递送,细胞水平评价该纳米复合物诱导肿瘤细胞增殖、迁移与侵袭抑制的效果及作用机制。在验证载体对miR-34a的递送效率后,进行LA-OEI/miR-34a纳米复合物的转染,能够有效诱导细胞产生凋亡,并使细胞周期阻滞在G1期,上述两种机制是肿瘤产生显著抗增殖效果的关键因素。此外,LA-OEI介导miR-34a递送后能够显著下调细胞中MMP-9和Notch-1的表达水平,实现对肿瘤细胞的迁移和侵袭的有效抑制。3.PEN介导小核酸miR-29a递送治疗肺癌的研究本研究利用Michael加成技术,实现了N-异丙基丙烯酰胺对PEI25K材料的修改,构建了一类衍生物,命名为PEN。在该修饰中,N-异丙基丙烯酰胺片段的引入,显著提升了载体材料的疏水性,同时其氨基密度基本没有受到影响,因此有助于提升其与细胞膜的相互作用,实现转染效率的提升。以恶性肿瘤中低表达miR-29a为研究对象,通过PEN介导miR-29a递送实现其在胞内的高效与稳定转染,结果表明,该体系介导miR-29a转染后,同样能够实现其对肿瘤增殖、迁移与侵袭的高效抑制,并对其作用机制进行了深入的研究。结论:本研究通过化学修饰成功合成了两种PEI衍生物,构建了高转染效率、低细胞毒性的阳离子基因递送载体LA-OEI和PEN,分别实现p53基因、miR-34a和miR-29a的成功递送,在细胞水平上取得了良好的递送与抗肿瘤作用效果,为恶性肿瘤基因治疗传输载体的设计与开发提供了新的策略,为基于PEI的恶性肿瘤基因治疗基础研究与临床应用奠定了良好的基础。