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目的观察冲击波对成肌细胞增殖分化以及对大鼠骨骼肌损伤修复的影响,为临床应用冲击波治疗骨肌疾病奠定基础。方法1、体外实验:采取混合酶消化法对大鼠骨骼肌成肌细胞进行原代分离培养。用不同强度冲击波对成肌细胞进行刺激筛选出最适强度。在此基础上将实验分为空白组、实验组(冲击波刺激)、阳性对照组(成肌诱导剂)验证冲击波对成肌细胞成肌分化效果的影响。利用形态学检测肌管形成情况;MTT法检测成肌细胞细胞增殖情况;流式细胞仪检测成肌细胞凋亡率;Western Blot检测转录因子(Pax7)、成肌分化因子(Myo D)、生肌决定因子(Myf6)、生肌决定因子(Myf5)、肌细胞生成素(Myo G)的蛋白表达情况;免疫荧光检测结蛋白(Desmin)、Pax7、Myo D的表达。2、体内实验:建立大鼠骨骼肌钝挫伤模型,造模成功后将实验分为冲击波治疗组、对照组。治疗组在损伤后第2天进行冲击波治疗,治疗组和对照组于治疗第1 d、4 d、7 d取损伤区域组织进行HE染色观察组织形态;免疫组化检测肌肉生长抑制素(Mstn)的表达,并利用图像分析软件进行平均光密度(average optical density,AOD)的分析;Western Blot检测Myo D、Mstn蛋白的表达水平。结果1、体外实验:对大鼠骨骼肌成肌细胞成功进行原代分离培养。MTT结果显示成肌细胞的活力对冲击波刺激呈剂量依赖性,能流密度越高细胞的存活率越低,中等能流密度时,冲击次数500次时显示细胞最高活力。流式细胞仪检测结果显示当冲击波刺激强度过高时,凋亡率明显高于空白组(P<0.05)。免疫荧光显示冲击波可促进Myo D蛋白表达上升,降低Pax7的表达。Western Blot结果显示冲击波可促进Myo D、Myf5、Myo G、Myf6蛋白表达水平显著增高(P<0.05),Pax7蛋白表达随着时间的延长,呈递减趋势,在1 d、3 d两组差异较明显(P<0.05)。Myo D蛋白两组随着时间延长蛋白表达水平逐渐升高,且实验组的表达水平均高于对照组,在3 d、5 d两个时间段有差异(P<0.05)。细胞形态学观察肌管融合结果显示,成肌细胞在冲击波刺激下呈现多核,对照组和实验组的融合指数与空白组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。2、体内实验:成功构建了大鼠骨骼肌钝挫伤的模型。HE染色结果显示对照组可见大量的炎症细胞浸润,肌纤维排列混乱。冲击波治疗组肌纤维萎缩逐渐减轻,炎症细胞浸润减少,期间可见大量新生细胞。Mstn免疫组化染色图片结果显示AOD值,对照组和治疗组的表达量在1 d、4 d、7 d呈现先上升后下降的趋势,治疗组在每个时间点的表达量均低于对照组(P<0.05)。Western Blot结果显示Myo D蛋白表达,治疗组的Myo D蛋白表达量随着强度的增加呈现上升后下降的趋势,0.14 m J/mm~2强度的表达量最高,均高于对照组(P<0.05),治疗组在1 d,4 d,7 d各个时间表达量均高于对照组(P<0.05)。Mstn蛋白表达显示各组强度在不同时间的蛋白表达均在伤后4 d表达量上升至最高,然后开始下降。各组表达量均随着时间的延长呈现上升后下降的趋势,在4 d时表达量最高,但是冲击波各强度组的表达量较对照组低,差异具有统计学意义(P<0.05),随着冲击强度的增加,表达量呈现逐渐减少的趋势,其中0.14 m J/mm~2能流密度下降较明显。结论1、ESW对成肌细胞的活力有影响,适宜强度下可促进细胞融合。2、ESW通过调控Pax7、Myo D、Myf5、Myf6、Myo G等蛋白的表达对成肌细胞增殖分化这生物学特性产生影响。3、大鼠骨骼肌损伤后经过ESW治疗可见新生细胞的数量明显增加,炎症细胞浸润减少,有利于修复受损骨骼肌。4、本课题为ESW作为减轻疼痛,促进骨骼肌损伤修复的一种新兴的治疗手段奠定了理论基础。