细菌小RNA （Small RNA, sRNA）是一类长度为50-500 nt,通常不编码蛋白但具有独立功能的RNA分子。研究表明,细菌小RNA在重金属离子代谢、环境应答、群体感应、生物膜的形成以及病原菌的致病性等方面发挥了重要的作用。细菌小RNA发挥功能的主要方式是通常与其靶标mRNA以碱基配对的方式结合从而影响该mRNA的翻译或稳定性,因此在转录后水平调控靶标基因的表达。十字花科黑腐病（Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc）是引起白菜、甘蓝、萝卜、油菜等重要十字花科作物黑腐病的病原菌,同时也是研究植物病原细菌致病机理的模式菌株之一。为了研究小RNA在Xcc中的作用,我们课题组几年前就开展了小RNA鉴定和功能研究工作。到目前为止,我们已经从Xcc中已鉴定了几十个小RNA；此外,我们还采用缺失和过量表达方法对部分小RNA进行了功能鉴定,但只有极少数的小RNA的生物学功能得到确定,而大部分小RNA的缺失和过量表达都没有观察到表型变化,说明大多数小RNA的功能是微效的,为此,本研究尝试通过鉴定小RNA的直接靶标来研究小RNA在细胞中的作用。我们的策略是,先用生物信息学预测目的小RNA的直接靶标,再用凝胶阻滞实验（EMSA）进行验证。在已鉴定的几十个Xcc小RNA中,我们选择了4个（sRNA-Xcc1、sRNA-Xcc2、sRNA-Xcc3和sRNA-Xcc4）表达丰度较高的小RNA作为我们的目的小RNA。我们首先用CopraRNA （Comparative prediction algorithm for small RNA target）软件预测了这4个小RNA的直接靶标。预测结果显示,在p值<0.01且q值<0.5的筛选条件下,sRNA-Xcc1、sRNA-Xcc2、sRNA-Xcc3和sRNA-Xcc4的靶标基因分别为27个、2个、3个和35个。接着我们选择了5个sRNA-Xcc1的预测靶标（XC₂374、XC₁589、XC₀611、XC₁788、XC₀721）,2个sRNA-Xcc2的预测靶标（XC₄321、XC₁078）,3个sRNA-Xcc3的预测靶标（XC₁548、XC₀725、XC₀690）和5个sRNA-Xcc4的预测靶标（XC₀760、XC₃379、XC₃499、XC₃561、XC₂308）进行EMSA实验验证。在进行EMSA前,我们先用5’RACE （5’Rapid Amplification of cDNA Ends）确定了候选靶标基因的转录起始位点。结果发现只有XC 0725的转录起始位点位于预测的sRNA-Xcc3的结合区位点之前。另外,我们课题组之前已经鉴定了XC4321的转录起始位点,也位于预测的sRNA-Xcc2的结合位点之前。于是,我们对这两个候选靶标进行EMSA验证。但是,EMSA结果显示sRNA-Xcc2和sRNA-Xcc3均不能与对应的预测靶标RNA结合,说明XC 4321不是sRNA-Xcc2的直接靶标,XC 0725也不是sRNA-Xcc3的直接靶标,或者它们与靶标的结合需要其它因子参与。为了明确sRNA-Xcc2和sRNA-Xcc3是否调控候选靶标基因的表达,我们用半定量RT-PCR检测了sRNA-Xcc3的过量表达菌株中候选靶标基因XC 0725的表达水平,以及sRNA-Xcc2的过量表达菌株和缺失突变体（将瑞萍博士之前构建）中候选靶标基因XC 4321的表达水平。结果发现,XC 4321在sRNA-Xcc2的过量表达菌株中的表达水平下降,在sRNA-Xcc2的缺失突变体中表达水平增加,说明sRNA-Xcc2负调控XC 4321的表达。sRNA-Xcc3的过量表达对XC 0725的表达水平没有影响,说明sRNA-Xcc3不参与XC 0725的表达调控。本研究采用生物信息学预测结合凝胶阻滞实验（EMSA）策略对4个Xcc小RNA的直接靶标进行了鉴定。虽然没有鉴定到它们的直接靶标,但发现sRNA-Xcc2负调控XC 4321的表达。由于EMSA结果显示sRNA-Xcc2不能与XC₄321mRNA结合,我们推测sRNA-Xcc2调控XC 4321的表达是间接的。究竟sRNA-Xcc2如何调控XC 4321的表达还需要进一步研究。