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目的现今肺癌的发病率和死亡率增长迅速,已成为人类死亡的主要原因之一,各细胞类型中以肺腺癌的增加尤为明显。临床发现多为中晚期,手术及放化疗的总体疗效不甚乐观,易出现局部复发及远处转移。基因治疗是目前肺癌治疗的研究热点之一,其中自杀基因(suicidegene)治疗被认为是最有应用前景的基因治疗方法。目前,诸多治疗基因中单纯疱疹病毒胸苷激酶HSV1-tk基因研究最多,是最具前景的具有催化放射性核素的“自杀基因”。此外,HSV1-tk还兼具报告基因功能,故建立携带tk基因的肺腺癌裸鼠动物模型后,可在活体状态下能表达胸苷激酶ΓK。18F、124I、131I等标记的核苷类似物作为底物进行反应后通过PET显像实时监测HSV1-tk自杀基因在靶细胞内的表达情况,为今后进一步深入研究肺癌的自杀基因治疗研究和监测奠定基础。同时,也可以为下一步进行双报告基因报告显像跟踪监测骨髓间充质干细胞的活体修复等工作奠定可行性基础。内容将外源自杀基因特异地导入肿瘤细胞内并在靶细胞内高效且稳定的表达是能否成功基因治疗肿瘤的关键。对患者体内的自杀基因分布转导情况和治疗状态进行实时检测分析也是整个治疗过程中不可或缺的部分。故本研究拟在前期研究的基础上利用逆转录病毒载体介导HSV1-tk自杀基因兼报告基因转染肺腺癌A549细胞,经筛选阳性转导细胞,再利用稀释法单克隆建立一种能稳定表达HSV1-tk基因肺腺癌细胞株A549-tk,观察其与正常A549细胞的形态和生长状态的区别。建立能在活体内长期、稳定、高效表达HSV1-tk基因的肺腺癌裸鼠动物模型。方法利用分子克隆技术扩增带Bg1II、Sa1I酶切位点的HSV1-tk全基因片段,插入逆转录病毒载体pDON-AI-2-Neo中,与gag-pol表达质粒pGP和env表达质粒pE-ampho利用脂质体法转染293T包装细胞,形成pDON-AI-2-Neo-HSVI-tk重组报告基因假病毒颗粒,然后用其转染肺癌A549细胞,经G418筛选阳性表达,再经有限稀释法单克隆获得稳定表达株,RT-PCR检测证实A549-tk细胞的外源HSV1-tk基因在mRNA水平的稳定表达。通过长时间的传代培养进行细胞的生长、形态观察并绘制细胞生长曲线。将克隆细胞株种瘤于裸鼠后,比较正常A549瘤和A549-tk瘤两者之间的生长差异,取动物模型的成瘤做RT-PCR检测到HSV1-tk基因的表达.结果重组质粒pDON-AI-2-Neo-HSV1-tk经过酶切、测序鉴定证明与GenBank基因库公布的HSV1-tk基因序列(gi：59974)完全一致。并与gag-pol表达质粒pGP和env表达质粒pE-ampho通过包装细胞制备成感染性假病毒颗粒。经G418抗生素阳性筛选及有限稀释单克隆法培养出含HSV1-tk基因的单克隆细胞株,RT-PCR检测证实外源基因HSV1-tk成功导入A549细胞。比较A549-tk细胞株和正常A549两者的生长及形态特征并绘制细胞生长曲线,结果发现两种细胞的外形基本一致,生长特征也无明显差别(P>0.05)。A549-tk细胞株和A549细胞的成瘤率均为100%。比较了两种细胞肿瘤的生长特征,发现正常A549瘤和A549-tk两者之间的肿瘤的生长大小并无明显差异(P>0.05)。三次传代后经RT-PCR检测表明,成功建立了能稳定高效表达HSV1-tk基因的动物模型。结论1重组质粒pDON-AI-2-Neo-HSV1-tk能在肺腺癌细胞A549进行正确的翻译表达。2外源基因HSV1-tk在成功制备的A549-tk细胞株中可被长期稳定表达。3外源基因HSV1-tk的导入并没有影响到A549细胞的正常生理功能和形态。4外源HSV1-tk报告基因导入A549细胞后对肿瘤的生长状况无明显影响。5本实验成功建立了能稳定高效表达HSV1-tk基因的动物模型。