论文部分内容阅读
大黄鱼（Larimichthys crocea）是中国重要经济海水养殖鱼类之一，为中国特有的地方性种类，人工养殖技术的成功使其成为目前网箱养殖量最大的鱼类，但是随着养殖量的增加和养殖环境的破坏，常常导致大面积疾病的爆发，其中副溶血弧菌（ Vibrio parahaemolyticus）是养殖大黄鱼中最常见的病原菌之一，给大黄鱼的养殖业造成了巨大的损失。本研究从大黄鱼免疫基因入手，首先克隆获得肿瘤坏死因子受体（ Tumor Necrosis Factor Receptor, TNFR）和免疫球蛋白重链（Immunoglobulin heavy chain, IgH）的cDNA全长。从实验室已构建的大黄鱼EST文库和前人的研究中筛选获得18个免疫相关基因：Toll样受体9（ toll-like receptor, TLR9）、Toll样受体22（ TLR22）、肿瘤坏死因子受体13B（TNFR13B）、RAC-GTP酶（RacGTPase， RAC）、白介素8（interleukin8, IL8）、白介素10（IL10）、干扰素调节因子1（interferon regulatory factor, IRF1）、主要组织相容性复合物II a（major histocompatibility complex II a, MHCII a）、微球蛋白β2（beta-2 microglobulin, B2-M）、CC趋化因子（CC Chemokine, CC）、似CC趋化因子114（CC Chemokine-like114, CCL114）、似CC趋化因子（CCL）、基质细胞衍生因子（stromal cell-derived factor1, SDF）、免疫球蛋白D（immunoglobulin D, IgD）、免疫球蛋白轻链（immunoglobulin light chain, IgL）、臂板蛋白4e（SEMA4e）、半胱天冬氨酸酶9（CASPASE9）和C1抑制因子（C1 inhibitor, C1-IN）。采用实时荧光定量PCR技术检测经副溶血弧菌注射后2 d、4 d、8 d和12 d时大黄鱼脾脏中上述基因的表达变化。主要的研究结果如下： （1）TNFR的cDNA全长为2016 bp，编码449个氨基酸。预测蛋白质分子量为49.7 kDa，等电点为5.47。SingalP分析其5’端含有一段信号肽（1-25 aa）。功能域分析发现其含有死亡域（360-436 aa），TNFR/NGFR富含半胱氨酸区域（87-127 aa,129-168 aa），死亡受体域（33-276 aa）和跨膜区域（10-30 aa,199-219 aa）。荧光定量PCR结果显示TNFR基因在雌性的卵巢中表达量最高，并且脾脏中TNFR在副溶血弧菌注射2 d和4 d实验组表达量显著高于对照组。 （2）IgH的cDNA全长为1917 bp，编码585个氨基酸。预测蛋白质分子量为65.2 kDa，等电点为5.84。SingalP分析其5’端含有一段信号肽（1-20 aa）。IgH含有一个82 aa的可变区（V区，V36-V117）和三个恒定区（C区，C157-C229C257-C334C476-C552）。荧光定量 PCR结果显示大黄鱼脾脏和头肾中IgH表达量显著高于其它检测的各组织，弧菌感染4 d时IgH的表达量显著高于未感染组。 （3）TLR22、IL10、C1-IN、IgD和IgL在注射后的2 d实验组表达量显著高于对照组，IRF1和SDF在大黄鱼应激4 d和8 d时实验组表达量均显著高于对照组，应激8 d时MHCII a的表达量显著高于对照组， IL8和RAC是在应激12 d时显著高于对照组。SEMA4e在应激2 d、8 d和12 d实验组表达量均显著高于对照组。CCL和CCL114在应激12 d时表达量显著下调，而CASPASE9、B2-M、TNFR13B、TLR9和CC在感染后其实验组和对照组无显著差异。 以上结果表明，在大黄鱼先天免疫中，脾脏扮演着一个很重要的角色。免疫相关基因在病原菌识别、信号传导等过程中发挥了重要作用。