急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）是临床上常见的一种危重并发症,其特征是肾小管坏死、肾功能下降,使慢性肾病和终末期肾病发病率上升,有较高的死亡率^[1]。由脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的败血症是引起AKI的最常见原因^[2,3]。其中巨噬细胞在AKI发生发展过程中发挥着重要作用。有研究表明,中脑星形胶质细胞来源神经营养因子（mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF）对于视网膜中巨噬细胞的极化具有调控作用,但是MANF是否可以通过调控肾脏巨噬细胞的极化而影响AKI进程目前尚无报道。在本研究中,我们在野生型（wild type,WT）和单核-巨噬细胞特异性敲除MANF(mono-macrophage-specific MANF knockout,M?MANF^-/-)的小鼠上构建LPS诱导的AKI模型,观察肾脏中巨噬细胞数目及种类的变化并探究MANF免疫调控作用的机制。结果表明,在AKI时,与WT小鼠相比,M?MANF^-/-小鼠的肾脏中巨噬细胞明显增多且向M1型极化,M2型无明显变化。同时,当AKI发生时,M?MANF^-/-小鼠肾脏巨噬细胞中Toll样受体4（Toll-like receptors 4,TLR4）表达水平上调、p65活化增多和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的表达水平也显著上调。我们的研究结果表明,在LPS诱导的AKI中,MANF可能通过进一步激活TLR4受体及其下游NF-κB信号通路和炎症基因的表达影响巨噬细胞的极化。目的研究MANF对LPS诱导的AKI中肾脏巨噬细胞的数量和种类的影响并探究其潜在作用机制。方法对WT和M?MANF^-/-小鼠腹腔注射10 mg/kg LPS持续3天,在第三天处死小鼠,收集肾脏组织及血液。将肾脏组织纵向解剖,一部分脱水包埋,制作石蜡组织切片;另一部分冷冻于液氮中,用于检测肾脏组织中细胞因子的m RNA及蛋白水平。通过HE染色、PAS染色、免疫组织化学染色、免疫荧光双标对肾脏进行组织学及病理学检测;通过实时荧光定量PCR检测组织中的m RNA水平;通过从腹腔中提取巨噬细胞进行体外培养,用于检测涉及TLR4/NF-B途径的信号分子或蛋白质。结果1. 小鼠单核-巨噬细胞中MANF特异性敲除的鉴定及AKI模型建立从M?MANF^-/-小鼠的腹腔中提取巨噬细胞,流式细胞术验证M?MANF^-/-小鼠中巨噬细胞中MANF的敲除效果,结果表明,仅有极少数巨噬细胞表达MANF,提示M?MANF^-/-小鼠MANF敲除成功。采用M?MANF^-/-小鼠制备LPS诱导的AKI模型,用HE染色和PAS染色证明小鼠AKI模型构建成功。2. 单核-巨噬细胞特异性MANF敲除加重LPS诱导的AKIM?MANF^-/-小鼠在LPS诱导的AKI中致死率较WT小鼠高;HE染色、PAS染色结果表明,与WT小鼠比较,M?MANF^-/-小鼠的肾脏结构紊乱更明显;血清生化学指标显示M?MANF^-/-小鼠肾功能异常,同时M?MANF^-/-小鼠血清中TNF-α水平升高。这些结果表明单核-巨噬细胞中MANF特异性加重LPS诱导的AKI。3. 单核-巨噬细胞特异性MANF敲除促进LPS诱导的巨噬细胞浸润及向M1极化利用免疫组化技术检测肾脏组织中免疫细胞的数量变化。结果发现,与WT小鼠比较,M?MANF^-/-小鼠肾脏组织中巨噬细胞数量增多,且趋化因子CCL2的表达也增多。利用免疫荧光双标和实时荧光定量PCR检测肾脏中巨噬细胞的亚型,结果表明小鼠单核-巨噬细胞中MANF敲除会促使巨噬细胞M1型转化,而M2型巨噬细胞的数目没有明显变化。4. 单核-巨噬细胞特异性MANF敲除激活TLR4受体。利用免疫组化和实时荧光定量PCR检测肾脏中TLR4水平,结果发现与WT小鼠相比,M?MANF^-/-小鼠肾脏组织中TLR4水平上调更为明显。从小鼠的腹腔中提取了巨噬细胞,用LPS进行刺激后使用RNA seq进行分析,结果表明与WT小鼠相比,在M?MANF^-/-小鼠的腹腔巨噬细胞中NF-κB表达上调更为明显。利用免疫组化和实时荧光定量PCR检测肾脏中p-p65和TNF-α水平,结果发现与WT小鼠相比,M?MANF^-/-小鼠肾脏组织中p-p65和TNF-α水平上调更为明显。结论1.单核-巨噬细胞特异性MANF敲除加重LPS诱导的AKI,并使肾脏中巨噬细胞数量增多且向M1型极化,而对M2型巨噬细胞无明显影响。2.在LPS诱导的AKI中,单核-巨噬细胞特异性MANF敲除可能进一步激活TLR4受体及其下游NF-κB信号通路。