阿尔茨海默病（Alzheimer disease（9）,AD）是一种神经退行性疾病。众所周知,AD的病理特征与Aβ42的水平增加有关。Aβ42是一种两亲性分子,因此随着其水平的提高,它很容易被自身或其他分子诱导,在体内或体外呈现错误的折叠构象,导致自我聚集,形成可溶性寡聚体和大分子不溶性纤维,最终累积成斑块沉积在大脑中。Aβ42在大脑中的聚集和沉积被认为是驱动AD发病机制的主要和起始的致病因素,而Aβ42聚集体,特别是Aβ42寡聚体已被认为是神经细胞的细胞外毒剂,它们逐渐损伤了神经细胞,并最终损伤了脑细胞的正常机能。由于在AD的不同发展阶段,胞外Aβ42的不同种类（species）,如单体（monomer）、寡聚体（oligomers）、纤维（fibrils）和不同形式（forms）,如可溶（soluble）或悬浮（suspended）、附着（attached）或沉积（deposited）的存在水平不同,它们对神经细胞的运动性（motility）、黏附性（adhesion）和神经突的发生（neurite outgrowth）以及与这些细胞机能密切相关的神经细胞支架蛋白各有怎样的影响,这些影响之间以及与相应Aβ42聚集体的神经毒性之间存在怎样的相关性目前尚不清楚,它们的神经毒性机理有哪些异同也尚未揭示。这些内容对确定AD治疗药物的靶向性和有效性均具有基础理论与实验指导意义。由于在AD模型动物上无法准确定位和评估Aβ42的不同聚集体（种类、形式）对神经细胞的损伤特性及其差异,难以揭示它们相关联的细胞学效应,所以有必要在分子和细胞水平上对这些不同存在形式和不同种类的Aβ42及其聚集体进行相应毒理学研究,以揭示它们对神经细胞的运动、生存和神经突发生等的影响,以及它们的毒理机制和内在联系,为AD治疗药物的研制提供实验依据与理论指导。本论文分别应用分化与未分化的神经细胞系SH-SY5Y细胞和原代海马神经元细胞系HT22细胞,系统地研究了Aβ42单体及其两种典型的聚集体（寡聚体、纤维）对神经细胞的迁移、黏附和神经突发生的影响,并研究了与这些细胞行为或过程密切相关的膜整合素（Integrin）受体和神经细胞支架蛋白（scaffold proteins）palladin的影响,旨在确定胞外不同Aβ42聚集体的神经毒性机理与相应的细胞学事件的联系,在分子和细胞水平上凝练胞外Aβ42及其聚集体的生物效应本质,促进对β-淀粉样蛋白神经毒理以及AD领域的研究与发展。本论文取得的主要研究结果如下:1.胞外Aβ42单体不会对神经细胞的运动性产生负面影响,相反在一定程度上能促进神经细胞对胞外毒性Aβ42聚集体的迁移性逃避（或规避）。然而,胞外Aβ42聚集体,尤其是Aβ42寡聚体,显着降低了神经细胞的迁移能力,同时降低了它们的存活率。相比之下,胞外可溶性（或悬浮性）Aβ42聚集体对神经细胞的存活影响更大,而胞外沉积性（或附着性）Aβ42聚集体对神经细胞的迁移能力影响更大。此外,所有胞外Aβ42聚集体形式对神经细胞的上述不利影响均能被抗寡聚化Aβ42的抗体HT7（本课题组研制的抑制/中和神经毒性Aβ42聚集体的小分子单链抗体）明显减弱（或抑制）。2.Aβ42聚集体的可溶性（或悬浮性）和沉积性（或附着性）形式在导致神经细胞变得惰性（运动性下降）方面表现出不同的效果,表明它们对神经细胞的作用机理存在一定的差异。进一步研究发现,对于与神经细胞膜整合素共定位的比例,胞外沉积性（或附着性）Aβ42聚集体高于可溶性（或悬浮性）Aβ42聚集体,但同时对于与神经细胞膜共定位的比例,胞外可溶性（或悬浮性）Aβ42聚集体高于沉积性（或附着性）Aβ42聚集体。3.通过分子对接分析发现,Aβ42主要通过其RHDS基序破坏了神经细胞膜整合素的功能链,最终导致神经细胞变得惰性,由此初步揭示了胞外沉积性（或附着性）Aβ42聚集体对神经细胞的迁移能力的影响较可溶性（或悬浮性）Aβ42聚集体更大的机理。因此,本论文提出了胞外神经毒性Aβ42聚集体的“锚定”观点,即胞外Aβ42聚集体的出现（或存在）好似大脑中出现（或存在）了一种不利的“锚”,它们通过锚定作用束缚了神经细胞并使神经细胞变得惰性。如果胞外Aβ42聚集体对神经细胞的这种锚定作用被切断或减少,即使“锚”本身没有被完全消除,运动性受损的神经细胞也可以恢复或被修复。4.基于细胞迁移与黏附的密切相关性,以及它们均与膜整合素的密切相关性,本论文进一步研究了胞外Aβ42聚集体对神经细胞黏附性的影响。在相同浓度下,胞外可溶性（或悬浮性）Aβ42聚集体要比沉积性（或附着性）Aβ42聚集体对神经细胞黏附能力的影响更大。通过进一步比较神经细胞的重黏附率和死亡率,发现,胞外Aβ42的神经毒性越大,其可溶性（或悬浮性）与沉积性（或附着性）形式之间的这些影响差异越明显,同时重新黏附的细胞（脱离黏附的活细胞）的存在也表明了,胞外毒性Aβ42聚集体对神经细胞的损害是渐进的。由此可以得出:胞外Aβ42聚集体的神经毒性越高,脱黏附的活细胞存活时间越短,它们走向死亡的速度越快,这不可避免地导致了神经细胞的高死亡率。此外,胞外Aβ42聚集体,尤其是的Aβ42高聚体或纤维的物理障碍效应也会对神经细胞的黏附造成不利的影响,即便被抗寡聚化Aβ42的抗体所结合,物理障碍效应可能仍然存在。由此可见,胞外Aβ42聚集体的物理障碍效应对神经细胞的迁移和黏附的影响是不同的。5.胞外Aβ42聚集体通过其生物效应和可能的物理效应对神经突发生与生长（或延伸）具有复杂、多样的不利影响,其中可溶（或悬浮）形式Aβ42聚集体主要影响了神经突的生长（或延伸）,而沉积（或附着）形式Aβ42聚集体主要影响了神经突的发生（或形成）。这意味着胞外不同形式的Aβ42聚集体以类似但不完全相同的模式和机制对神经突的发生和生长产生不利影响,并因此以不同的重点（从不同方面）损害神经突。然而,结果是这两个方面中的任何一个方面的负面影响最终都会损害神经突的突起网络。6.胞外不同种类和形式的Aβ42聚集体诱发了细胞内palladin水平和亚细胞定位的不同变化,这也表明了它们影响神经细胞的机制可能不同,并由此提出:胞外可溶（或悬浮）形式的Aβ42聚集体通过神经细胞的更大表面积发挥其毒性效应,而胞外沉积（或附着）形式的Aβ42聚集体仅通过神经细胞的有限表面积发挥其毒性效应。尽管支架蛋白palladin对细胞迁移、黏附和神经突发生/生长均很重要,但它的上调只有在特定条件下才是有益的,否则它的上调可能最终会诱发细胞凋亡,而这可能是一个生理上的程序化过程,是受到严格的时空调控的,所以支架蛋白palladin似乎是调节神经细胞的一把双刃剑。因此,神经细胞在对特定种类和形式的细胞外Aβ42的响应中,每一种palladin的水平和分布的组合都会产生独特的神经突生成模式（长度和数量）。7.哺乳动物细胞中存在多种palladin异构体（isoforms）,而神经细胞中较重要的是其异构体3（140k Da）和异构体4（90k Da）。为了进一步分析这两种异构体胞外不同Aβ42聚集体存在下的具体变化,基于这两种异构体中特有的一段氨基酸序列PalΔ11-15（656-879位氨基酸残基）,本论文专门制备了靶向该序列的抗体。该抗体经检测对palladin异构体3（140k Da）和异构体4（90k Da）具有良好的特异性。应用制备的抗PalΔ11-15的抗体确定了上述所有组别的靶胞内palladin异构体3（140k Da）和异构体4（90k Da）水平变化,其中异构体3（140k Da）的变化较为明显,并与总palladin水平变化一致,而异构体4（90k Da）相对稳定,几乎无变化。这表明,palladin异构体3（140k Da）可能是神经细胞内主要响应了胞外Aβ42聚集体,并与神经细胞迁移、黏附和神经突生长（包括数量和长度）损伤相关联的palladin分子。胞外Aβ42聚集体可能起细胞外束缚性基质的作用,其产生的锚定效应（或束缚效应）会诱发被束缚的神经细胞细胞内物质发生相应的变化。本论文的研究结果表明,Aβ42在胞外的聚集和沉积扰乱了神经细胞与胞外基质之间的正常相互作用,同时束缚住了神经细胞,这可能是这些胞外Aβ42聚集体,尤其是Aβ42寡聚体的神经细胞毒性的部分本质。当然,在生理条件下,胞外Aβ42的聚集和沉积可能是非常缓慢的,所以对神经细胞的束缚过程也可能是缓慢且漫长的。这也正是神经退行性疾病如阿尔茨海默病预防与治疗的难点所在。基于以上本论文的所有研究结果以及所提出的胞外Aβ42聚集体对神经细胞的“锚定”的观点,我们将在今后进一步的研究中,从胞外-胞内,体外-体内多个层面研究如何有效消除这些不利的“锚”,以及如何保护神经细胞的运动机能、代谢机能和神经网络的完整性等,继续为早日攻克阿尔茨海默病等尽一份绵薄之力。