研究背景核因子-κB( nuclear factor-kappa B , NF-κB)是一种广泛存在于哺乳动物多种细胞具有多向性调节作用的蛋白质分子,是细胞中一个对环境改变发生应激反应的转录因子,它调节大量与细胞应激反应、炎症反应、免疫应答和细胞抗凋亡等相关的基因的转录。NF-κB活化的失调参与多种疾病的发生、发展过程,例如感染性休克(脓毒症)、多脏器功能衰竭等烧伤临床上常见,目前尚缺乏特异的治疗方法的并发症,而NF-κB在这些并发症的发生发展过程中起着非常重要的作用;其他如缺血再灌注损伤、类风湿关节炎、支气管哮喘、动脉粥样硬化、溃疡性结肠炎、老年性痴呆、肿瘤细胞抗凋亡及艾滋病(AIDS)等的发生和发展也都与NF-κB的过度活化直接相关。NF-κB是一个进化高度保守的在许多生命过程中发挥重要作用并主要对环境变化产生应答的转录因子,主要是以p50/p65异二聚体形式普遍存在于细胞浆中的一种快反应转录因子,与NF-κB抑制蛋白(IκB)结合而呈非活性状态。研究表明它可以被多种刺激剂,如内毒素(LPS)、TNF-α(tumor necrosis factor-alpha )、IL-1(interleukin 1)、神经生长因子、蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)激活剂、有丝分裂原、氧化剂、细菌、病毒、免疫刺激剂、自由基以及紫外线等激活。激活的NF-κB与IκB解离后转位入核与靶基因启动子/增强子上的κB位点结合,从而调节许多靶基因的表达,因此被誉为控制早期基因表达的开关。通过靶基因表达产物,NF-κB参与了感染、炎症、免疫反应、细胞凋亡和肿瘤等病理过程以及细胞周期调控与细胞分化等。调节和控制NF-κB活性是缓解组织损伤的一种有力策略,因此深入研究NF-κB信号转导通路,探索细胞内NF-κB活化阻断剂,可能为临床治疗开辟新途径。近年来,研究发现NF-κB信号系统受到许多金属元素的影响。如金、锌、铜等不同化合物均可通过抑制IKK(sIκB kinases, IκB激酶)的活性来阻断NF-κB的活化;金精三羧酸主要通过强烈抑制NF-κB与DNA结合来控制艾滋病毒HIV活性;许多金属如金、钯、镍及汞亦可影响NF-κB与DNA结合从而调节靶基因的激活。镧是一种化学性质十分活跃的稀土金属,研究证实稀土具有抗菌、促进创面愈合、调节细胞免疫功能等作用。临床上,稀土已经在磁共振、时间分辨检测、放射性同位素诊断中用作诊断试剂,铈浴法还用于治疗烧伤患者;2004年10月,碳酸镧被美国FDA批准用于临床治疗磷酸水平高的血透患者。我们的前期研究工作证明稀土化合物氯化镧对LPS引起的体内效应有明显的拮抗作用。实验表明镧可降低内毒素血症小鼠炎症介质水平,减轻内毒素对机体主要脏器的损伤,对致死量内毒素攻击小鼠具有明显的保护作用。本课题拟通过分析氯化镧对多种细胞内NF-κB上游相关信号分子以及NF-κB系统内部的信号分子表达及活化的影响,并观察氯化镧对LPS诱导NF-κB所调控的下游炎症反应介质表达的影响,探索镧抑制NF-κB活化的可能机制,为临床感染性休克(脓毒症)、多脏器功能衰竭等疾病的治疗提供新思路,并为开发稀土的药用价值提供实验依据。第I部分氯化镧对内毒素诱导NF-κB上游信号分子的作用目的分析氯化镧对LPS诱导NF-κB上游信号分子的表达和活化的影响。方法:1.细胞培养及分组:RAW264.7巨噬细胞:以含5%胎牛血清的DMEM/F12液体培养基稀释细胞密度为1×106个/ml,分别接种于去热原培养瓶中及预先放置无菌去热源盖玻片的24孔培养板中,于5%CO2、37℃恒温培养,实验随机分组如下:①LPS组:以含1μg/ml LPS的无血清DMEM/F12液体培养基培养RAW264.7细胞。②氯化镧+LPS组:以含氯化镧2.5μmol/L(经预实验证明该浓度可以有效抑制NF-κB的活化)的无血清培养基培养RAW264.7细胞4h后,弃培养基并以无热原生理盐水漂洗细胞三遍,再加入含1μg/ml LPS的培养基继续培养。③空白对照组:培养基为不含血清的DMEM/F12,不加氯化镧和LPS。④氯化镧对照组:以含氯化镧2.5μmol/L的无血清DMEM/F12培养基培养RAW264.7细胞。按检测指标要求分别于不同时间段收集培养上清、细胞及细胞爬片待检。2.检测指标:(1)观察氯化镧对LPS诱导RAW264.7细胞表面Toll样受体4(TLR4)基因表达(转录和翻译)的作用:利用流式细胞术及逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术分析TLR4基因表达情况;(2)氯化镧对LPS活化NF-κB上游部分信号通路的影响:①观察氯化镧对LPS诱导RAW264.7细胞p38MAPK蛋白表达和磷酸化的作用:采用细胞免疫荧光染色分析p38MAPK/p-p38MAPK在巨噬细胞细胞中的分布与表达;免疫印迹技术(Western blot)测定巨噬细胞内p38MAPK蛋白表达和磷酸化水平的改变。②观察氯化镧对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞中PKC蛋白表达和磷酸化的作用:采用细胞免疫荧光染色分析PKC在巨噬细胞的表达和磷酸化转位情况; Western blot测定巨噬细胞内PKC蛋白表达和磷酸化水平的改变。结果:(1)氯化镧对NF-κB上游信号膜受体(TLR4)表达的作用:利用流式细胞术及逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术分析1μg/ml LPS刺激后巨噬细胞表面TLR4的表达及氯化镧的影响,结果表明LPS能够显著上调巨噬细胞TLR4基因和胞膜TLR4蛋白的表达,尽管氯化镧(2.5μmol/L)本身不上调巨噬细胞TLR4基因的表达,氯化镧亦不能抑制LPS诱导巨噬细胞表面受体TLR4的基因的表达。(2)氯化镧对LPS活化NF-κB上游部分信号通路的影响:①p38 MAPK信号通路:1μg/ml LPS能够有效激活RAW264.7巨噬细胞的p38MAPK信号通路,氯化镧(2.5μmol/L)自身不激活该信号通路同时也不能阻断LPS介导的p38蛋白的表达和磷酸化。②PKC信号系统:1μg/ml LPS同样能够有效激活RAW264.7巨噬细胞的PKC信号,令PKC蛋白表达和磷酸化水平显著升高,并从胞浆转位至胞膜。2.5μmol/L氯化镧即能够有效阻断LPS诱导的PKC蛋白表达和磷酸化水平升高及膜易位。结论:氯化镧通过阻断NF-κB上游PKC信号通路,从而可能部分抑制NF-κB信号通路的活化。第II部分氯化镧对NF-κB信号通路中关键分子活化作用的分析目的观察不同激活机制下(激活物分别为LPS及TNF-α,靶细胞分别为RAW264.7及Hela细胞及NF-κB组成性活化细胞株U266),氯化镧对各细胞中NF-κB信号通路关键分子的蛋白表达和磷酸化及NF-κB/p65亚基与靶基因结合能力的影响,探索氯化镧抑制NF-κB活化的可能作用位点。方法1.细胞培养及分组:(1)RAW264.7细胞:(同上)(2)Hela细胞:以1×106个/ml接种细胞于含10%胎牛血清的RMPI 1640液体培养基中,于5%CO2、37℃恒温培养,随机分组如下:①TNF-α组:以含TNF-α20ng/ml的无血清RMPI 1640液体培养基培养Hela细胞。②氯化镧+TNF-α组:分别以含氯化镧5 , 25, 50和100μmol/L的RMPI 1640培养基培养Hela细胞4h后弃培养基并以无热原生理盐水漂洗细胞三遍,再加入含TNF-α20ng/ml的培养基继续培养。③空白对照组:培养基为不含血清的RMPI 1640,不加氯化镧和TNF-α。④氯化镧对照组:以含氯化镧100μmol/L的RMPI 1640培养基培养Hela细胞。各组细胞根据检测方法的要求分别培养于24孔培养板(孔中预先放置无菌盖玻片)或培养瓶中,于30min后,收集培养上清、细胞及盖玻片待检。(3) U266细胞:以1×106个/ml接种细胞于含15%胎牛血清的RMPI 1640液体培养基的培养瓶中,于5%CO2、37℃恒温培养,细胞悬浮生长,隔天半量换液,实验分组如下:①空白对照组:培养基为不含血清的RMPI 1640,不给予任何干预和刺激。②氯化镧对照组:分别以含氯化镧2.5, 5 ,25,50和100μmol/L的无血清培养基培养U266细胞。各组细胞根据检测方法的要求分别培养于培养瓶中,30min后收集培养细胞待检。2.检测指标:(1)Western blot技术测定IκB上游激酶IKKα, IKKβ的表达和磷酸化情况;(2)Western blot技术测定胞浆提取物中IκBα蛋白表达和磷酸化水平;(3)细胞免疫荧光染色技术分析NF-κB/p65蛋白在细胞中的表达和分布;(4)Western blot技术测定胞核提取物中NF-κB /p65蛋白表达水平;(5)Transcription Factor Assay kit试剂盒(酶联免疫吸附技术(ELISA))测定胞核提取物中p65蛋白与DNA靶序列结合能力。结果1.氯化镧对LPS诱导的巨噬细胞NF-κB信号通路中关键分子表达和/或活化的影响:(1)氯化镧对LPS诱导的NF-κB活化的抑制作用:氯化镧(2.5μmol/L)能够显著抑制LPS诱导NF-κB/p65自胞浆转位到细胞核,并且显著减弱NF-κB/p65与靶DNA结合活性。(2)氯化镧对LPS诱导的IκBα降解的抑制作用:氯化镧显著抑制LPS诱导的胞浆IκBα降解,从而抑制了NF-κB/p65自胞浆转位到细胞核。(3)氯化镧对LPS诱导的IκBα磷酸化的抑制作用:氯化镧不能阻断LPS介导的RAW264.7巨噬细胞中IκBα的磷酸化。(4)氯化镧对LPS诱导的IKKs活性的影响:氯化镧不影响RAW264.7巨噬细胞中IKKα/β表达和磷酸化水平,从而不能阻断LPS介导的IκBα的磷酸化。在RAW264.7细胞株中,NF-κB激活剂LPS诱导IKKβ及IκBα磷酸化,令IκBα降解,最终使NF-κB/p65转位入核与靶基因结合。氯化镧虽然不能阻断IKKβ及IκBα磷酸化,但是能够阻止RAW264.7细胞中IκBα的降解,并抑制NF-κB/p65转位入核并抑制NF-κB/p65与靶基因的结合活性,最终阻断NF-κB信号转导通路。2.氯化镧对TNF-α诱导的Hela细胞NF-κB信号通路中关键分子表达和/或活化的影响:(1)氯化镧对TNF-α诱导的NF-κB活化的抑制作用:25-100μmol/L氯化镧能够显著抑制TNF-α诱导NF-κB/p65蛋白表达水平并抑制其自胞浆转位到细胞核,5-100μmol/L氯化镧还能显著减弱Hela细胞中NF-κB/p65与靶DNA结合活性,上述抑制效应呈剂量依赖关系。(2)氯化镧对TNF-α诱导的IκBα磷酸化和降解的抑制作用:TNF-α能够诱导Hela细胞中IκBα的磷酸化和降解。随着氯化镧处理的浓度不断升高,IκBα表达水平逐步升高,而磷酸化水平不断降低。表明氯化镧能够抑制TNF-α诱导的IκBα的磷酸化和表达水平的降低,且该效应随着随着氯化镧浓度的升高而逐步增强。(3)氯化镧对LPS诱导的IKKs活性的影响:氯化镧不影响Hela细胞中IKKα/IKKβ蛋白的表达水平。静息状态的Hela细胞几乎不表达p-IKKβ,而在TNF-α诱导下p-IKKβ水平则明显升高,随着氯化镧处理浓度的逐渐升高,p-IKKβ水平逐步下降,50-100μmol/L氯化镧能够显著抑制TNF-α诱导Hela细胞中IKKβ的磷酸化。NF-κB的另一个激活剂TNF-α,亦通过磷酸化IKKβ及IκBα,导致IκBα降解,最终亦使NF-κB/p65转位入核与靶基因结合,启动相关基因的表达。在Hela细胞株中,氯化镧不仅能够抑制IκBα的降解和NF-κB/p65转位入核,阻断NF-κB/p65与靶基因的结合,还能够阻断IKKβ及IκBα磷酸化。可见在不同细胞及激活条件下,氯化镧抑制NF-κB信号通路的靶点不完全相同。3.氯化镧对U266细胞中NF-κB的组成性活化(constitutive activation)的影响:(1)氯化镧对NF-κB组成性活化的作用:0-100μmol/L的氯化镧不能抑制NF-κB的组成性活化,逆转p65蛋白的移位。(2)氯化镧对U266细胞中IκBα蛋白的表达和磷酸化的作用:0-100μmol/L氯化镧亦不能影响IκBα蛋白的表达和磷酸化水平。(3)氯化镧对U266细胞中IKKs活性的影响:0-100μmol/L的氯化镧对U266细胞中IKKα/IKKβ蛋白的表达和磷酸化水平影响不明显。(4)氯化镧在胞外条件下,对U266细胞核提取物中NF-κB/p65与DNA的结合能力的影响:实验表明在细胞外条件下,5μmol/L氯化镧即能够显著抑制p65蛋白与靶DNA结合活性,并且该抑制效应随着氯化镧浓度的增高不断增强,100μmol/L氯化镧能够完全抑制胞核提取物中NF-κB/p65与靶DNA的结合。研究结果提示:对于NF-κB组成性活化U266细胞,氯化镧不影响IKKβ的磷酸化及IκBα的磷酸化和降解,并无法逆转NF-κB转位,但能够在细胞外条件下阻断NF-κB/p65与靶DNA的结合。第III部分氯化镧对LPS诱导NF-κB调控的炎症介质表达的影响目的通过观察氯化镧对LPS诱导的炎性因子TNF-α、NO及诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)表达水平及活性的作用,了解氯化镧对LPS诱导NF-κB下游靶基因表达的影响。方法(1)实验分组:(同第I部分)。(2)逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)测定TNF-α及iNOS基因表达水平。(3)酶联免疫吸附技术(ELISA)测定细胞上清中TNF-α含量。(4)细胞免疫荧光染色技术分析iNOS蛋白在细胞中的表达和分布。(5) Western blot技术测定细胞中iNOS蛋白表达水平。(6)硝酸还原酶法检测培养上清NO含量。结果(1)氯化镧对LPS诱导的NF-κB下游炎症介质TNF-α表达和释放的抑制作用:2.5μmol/L氯化镧不仅能够下调静息状态下巨噬细胞TNF-α基因的表达和多肽的释放还能够显著抑制LPS上调TNF-α基因表达和多肽释放。(2)氯化镧对LPS诱导NF-κB下游基因iNOS表达的抑制作用:2.5μmol/L氯化镧能明显下调iNOSmRNA的表达水平,减少iNOS蛋白的生成,显著降低产物NO的生成。研究结果提示氯化镧可通过抑制iNOS基因及蛋白的表达水平而控制NO的生成。结论:本研究结果(第I-第III部分)提示,氯化镧可通过阻断NF-κB上游PKC信号通路,从而部分抑制NF-κB信号通路的活化;氯化镧还能阻断IKKβ及IκBα磷酸化,抑制IκBα的降解和NF-κB/p65转位入核,并抑制NF-κB/p65与靶基因的结合,最终阻断NF-κB信号转导,从而下调炎性介质基因的表达和释放。