半乳糖苷酶是一种水解半乳糖苷键的糖苷酶,在食品、药品和造纸等工业中应用广泛,可降解半乳聚糖和半乳寡糖等。同时,也可以用于多糖结构修饰和解析中。阿拉伯半乳聚糖在植物组织中含量丰富,功能多样,是一种重要的半乳聚糖。阿拉伯半乳聚糖的构效关系研究一直受限于其结构分析,所以寻找专一性好的半乳糖苷酶对研究其构效关系具有重要意义。植物乳杆菌作为一种肠道益生菌能够代谢半乳聚糖,基因组学研究表明其含有多种β-半乳糖苷酶基因。本论文对其β-半乳糖苷酶进行重组表达和酶学性质研究,以期发现和制备能够用于分析阿拉伯半乳聚糖的酶。具体研究成果如下:1.以植物乳杆菌基因组为模板,成功克隆出两个β-半乳糖苷酶基因lpgal42和lpgal2,分别属于糖苷水解酶家族42（GH42）和家族2（GH2）。将目的基因与pET-28a（+）载体连接后转移到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,获得重组菌株lpgal42-pET-28a（+）-BL21（DE3）和lpgal2-pET-28a（+）-BL21（DE3）。重组菌株在25℃ 0.5mM IPTG条件下诱导16 h,可实现重组蛋白LpGal42和LpGal2的可溶性表达,经过Ni sepharose fastflow亲和柱层析后可得到纯度较高的目的蛋白,分子量分别为55 kDa和40 kDa。为了提高蛋白的表达量,利用5 L发酵罐对重组菌株进行高密度发酵,目的蛋白LpGal42和LpGal2表达量分别是摇瓶培养的10.2倍和7.6倍。2.分别以β-1,6-半乳聚糖（β-1,6-G）和对硝基苯基-β-D-半乳糖苷（pNPβGal）为底物对重组酶LpGal42和LpGal2的酶学性质进行了研究,结果表明:LpGal42比酶活为0.2 U/mg,最适pH为6.0,最适反应温度为40℃;LpGal2比酶活为2.2 U/mg,最适pH为7.0,最适反应温度为45℃。离子耐受实验结果表明,Mg²⁺和Na⁺能够促进两种酶的酶活力,其中Mg²⁺使LpGal42和LpGal2的酶活力分别提升至原来的115%和126%,而Cu²⁺、Fe³⁺、Ba²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺、Li⁺、Ni²⁺和SDS对这两种酶有较强的抑制作用。3.以一系列对硝基苯基糖苷、β-1,3/1,4/1,6-半乳二糖和β-1,3/1,4/1,6-半乳聚糖为底物对重组酶LpGal42和LpGal2的底物选择性进行研究。LpGal42只能降解β-1,6-半乳聚糖,产物以β-1,6-半乳二糖为主。LpGal2则能够降解pNPβGal、β-1,6-半乳二糖和β-1,6-半乳聚糖,释放出半乳糖。LpGal42和LpGal2对其他类型多糖水解结果显示,LpGal42和LpGal2不能降解β-1,3/1,4-半乳聚糖、葡聚糖、木聚糖和阿拉伯聚糖等多糖底物。上述结果表明,LpGal42为专一性好的内切-β-1,6-半乳糖苷酶,而LpGal2则为外切-β-1,6-半乳糖苷酶,这是首次发现专一性好的外切-β-1,6-半乳糖苷酶。4.以Ⅱ型阿拉伯半乳聚糖（AG-Ⅱ）为底物,利用上述重组表达的LpGal42和LpGal2进行酶解。由于AG-Ⅱ结构复杂,糖基连接方式多样,发现两种β-1,6-半乳糖苷酶单独或混合使用均不能降解AG-Ⅱ。但LpGal42和LpGal2可以与外切-β-1,3-半乳糖苷酶PpGal43和内切-β-1,3-半乳聚糖酶FvEn3Gal共同发挥作用水解AG-Ⅱ。该结果展示了LpGal42和LpGal2在AG-Ⅱ酶解修饰和结构分析中的应用潜力。综上所述,本论文发现和制备了两种专一性较好的β-1,6-半乳糖苷酶LpGal42和LpGal2。研究结果不仅丰富了β-1,6-半乳糖苷酶的种类,同时也为AG-Ⅱ等含有半乳糖的糖类化合物的酶解修饰和结构分析提供了新的工具。