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作为传统中药,虫草属(Cordyceps spp.)真菌因其抗肿瘤、免疫调节、抗氧化等作用一直备受关注,其中最著名的是寄生于高山蝙蝠蛾(Hepialus armoricanus)幼虫的冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)和寄生于鳞翅目蛹的蛹虫草(Cordycepsmilitaris)。在亚洲国家,虫草作为保健品的运用越来越广泛。其中,因为天然资源稀缺、人工培养困难等因素导致冬虫夏草的价格昂贵,而具有类似药用价值的蛹虫草则逐渐成为冬虫夏草的替代品。然而,随着蛹虫草人工培育体系的逐渐完善,市场上出现诸多以液体发酵得到的菌丝或人工培养基上诱导的子实体制成的胶囊片剂等,这在便利了蛹虫草的市场运用的同时,也带来了新的问题,最为关注的问题莫过于“人工培养的蛹虫草和天然蛹虫草是否相同”。另外,和蘑菇等经济型真菌类似,蛹虫草在继代培养和工业生产中同样存在着高频率的菌株退化问题(具体表现在缺失有性生殖或者无性生殖的繁殖能力),如何改善甚至逆转蛹虫草培养中的退化现象则随之成为另一个重要的问题。 本研究通过表达序列标签(EST)分析技术,探索了蛹虫草在不同培养条件及不同发育阶段过程中的转录组。构建了分别代表蛹虫草液体培养生长阶段、人工培养基上进行子实体生长的早期和末期阶段以及注射家蚕蚕蛹生长的子实体生长末期阶段的四个cDNA文库,对挑选出的5000多个克隆进行了测序。装配后得到的1341个unigene,包括454个contig和887个singleton。四个文库间的基因转录差异显著,只有2.1%的共有unigene。基因注释分析指出不同文库间的基因表达模式十分不同,相比有性生殖过程,蛹虫草在无性生殖阶段特异性的上调了更多细胞代谢、能量代谢以及压力应答相关的基因,其中蛹虫草在蚕蛹或人工固体培养基上产生子实体的类似阶段,相互间的基因表达特征也存在显著差异。但是,两个文库均包括丰富的细胞壁结构相关转录本,具体来说,接种米饭培养基构建的文库中38.72%的unigene为细胞壁结构相关基因,注射蚕蛹构建的文库中这一比例为26.35%。 另外,本研究克隆了模式真菌构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的抗氧化酶—谷胱甘肽过氧化物酶编码基因gpxA,通过基因敲入的方法使其在两株不同的蛹虫草(包括正常产生子实体的Cm01菌株和在不同培养基上丧失了子实体生长能力的Cm04菌株)中持续表达。过表达gpxA后,蛹虫草菌株内谷胱甘肽过氧化物酶总酶活性提高,清除细胞内活性氧的能力提高,退化菌株Cm04恢复子实体结实能力,且其中一株转化株在继代培养十代之后仍可产生子实体,原本就正常产生子实体的Cm01菌株仍然保持良好的子实体生长能力。 总之,基于“基因表达特征决定产物种类”的理论,本论文的研究成果说明人工培养基与蚕蛹培养基获得的子实体之间存在活性成分的差异;EST分析所获得的蛹虫草基因资源为进一步开展基因功能研究奠定了良好的基础;遗传改造的研究结果为蛹虫草菌株退化法理提供了可操作的技术手段。