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背景与目的自发性脑出血(Spontaneous Intracerebral hemorrhage)是非外伤性脑实质内出血,具有高致残率与高死亡率的特点。研究表明,肠道菌群相关的免疫反应与脑血管病的预后相关,且肠道菌群代谢产物氧化三甲胺(trimethylamine oxide,TMAO)被认为是与缺血性脑血管病发病相关的独立于传统危险因素的新型危险因素之一。亦有研究认为TMAO可能加重阿尔茨海默病患者的认知功能障碍。目前,TMAO在脑部疾病的病理生理过程中的具体作用尚不清楚。为了进一步探讨自发性脑出血急性期的病理生理机制,发现脑出血有效的治疗靶点,本研究通过给予高胆碱饮食升高小鼠血清中TMAO的浓度研究了 TMAO对急性脑出血小鼠脑部炎症反应、脑损伤程度与神经功能的影响,论证了 TMAO是否能够促进脑出血后血肿周围的炎症反应并加重脑损伤程度及神经功能的缺损,研究结果可能为脑出血的防治提供部分理论支持。方法1.实验动物与分组:无特定病原体(SPF)级雄性C57BL/6小鼠,10-12月龄,体重约25-35 g,共144只,按随机数字表法随机分成4组:(1)假手术+普通饮食组(sham+control组):术前给予普通饮食6周;(2)假手术+高胆碱饮食(sham+choline组):术前给予普通饲料+1.2%胆碱饮食6周;(3)脑出血+普通饮食(ICH+control组):术前给予普通饮食6周,术中向左侧纹状体注射0.5 ul含有0.075 U Ⅶ型胶原酶的无菌生理盐水;(4)脑出血+高胆碱饮食(ICH+choline组):术前给予普通饲料+1.2%胆碱饮食6周,术中向左侧纹状体注射0.5 ul含有0.075 UⅧ型胶原酶的无菌生理盐水。术后各组小鼠按照分组继续给予相对应的饮食,直至实验结束。2.建立脑出血小鼠模型:采用脑立体定位注射法向左侧尾状核注射0.5 ul含有0.075 UⅦ型胶原酶的无菌生理盐水诱导脑出血小鼠模型;尾状核的位置为:以前囟为原点,向前0.60 mm,向左2.00 mm,进针深度3.20 mm。术后改良的神经系统严重程度评分(NDS评分)小于4分视为造模失败。除微量注射器只进针不泵入胶原酶外,假手术组其他操作与脑出血组相同。3.实验观察指标:(1)于脑出血术后24 h、72 h通过UHPLC-MS/MS检测各组小鼠血清中TMAO的浓度。(2)于脑出血术后24h通过Western Blot检测各组小鼠血肿周围P38丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase,MAPK)髓样分化因子 88(Myeloid differentiation facter 88,MyD88)、高迁移率族蛋白-1(High mobility group box1 protein,HMGB1)及白介素-1β(Interleukin,IL-1β)的相对表达水平。(3)于脑出血术后72 h通过Luxol Fast Blue/Cresyl Violet染色、免疫荧光染色检测各组小鼠脑出血急性期脑损伤程度、脑肿胀程度、血肿周围小胶质细胞与星形胶质细胞的活化情况及中性粒细胞的浸润情况,于脑出血术后72 h通过干湿重法检测脑组织含水量,并于脑出血术后28天通过Luxol Fast Blue/Cresyl Violet染色检测脑出血远期残余病灶体积、脑萎缩及脑白质损伤程度。(4)于脑出血术后1、3、7、14、28天通过改良的神经功能评分(NDS)、转角试验评价脑出血小鼠行为学改变,并在整个实验过程中记录小鼠体重变化、肛温及存活情况。4.统计学方法:使用SPSS 23.0、Graphpad Prism7进行统计分析。计量资料用均数±标准差(x±s)表示。采用t检验、ANOVA方差分析、非参数检验进行组间差异性比较,ANOVA方差分析后采用Bofferroni检验进行两两比较。小鼠死亡率的比较采用χ2检验进行统计学分析。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.高胆碱饮食对小鼠血清中TMAO浓度的影响。UHPLC-MS/MS检测结果表明,高胆碱饮食能显著升高假手术组小鼠血清中TMAO的浓度,与普通饮食假手术组小鼠比较差异有统计学意义(n=6 mice/group,P=0.01)。高胆碱饮食小鼠脑出血术后24h、72 h血清中TMAO的浓度较假手术组相比有所下降。脑出血术后24 h,高胆碱饮食小鼠血清中TMAO的浓度显著高于普通饮食小鼠(n=6 mice/group,P=0.03)。脑出血术后72 h,虽高胆碱饮食小鼠血清中TMAO仍高于普通饮食小鼠,但差异无统计学意义(n=6 mice/group,P>0.05)。2.TMAO对脑出血小鼠脑部组织形态学及脑组织含水量的影响脑出血术后72h,普通饮食与高胆碱饮食小鼠均有不同程度的脑损伤、脑肿胀及血肿同侧大脑半球脑含水量的升高,但脑出血术后72 h两组小鼠脑损伤体积、脑肿胀及血肿同侧大脑半球脑含水量的比较均无统计学意义(n=8 mice/group,P值均大于 0.05)。3.TMAO对脑出血小鼠脑部炎症反应的影响脑出血术后24h,高胆碱饮食小鼠血肿周围MyD88的表达明显高于普通饮食小鼠,差异有统计学意义(n=6 mice/group,P=0.001);脑出血术后24 h,高胆碱饮食与普通饮食小鼠血肿周围P38 MAPK、HMGB1及IL-1β的比较,差异均无统计学意义(n=6 mice/group,P值均大于0.05)。脑出血术后72h,普通饮食与高胆碱饮食小鼠血肿周围均有小胶质细胞及星形胶质细胞的活化、中性粒细胞的浸润。但与普通饮食脑出血小鼠相比,高胆碱饮食小鼠血肿周围活化的小胶质细胞及星形胶质细胞的数量明显增多,差异有统计学意义(n=6 mice/group,P=0.01)。4.TMAO对脑出血小鼠远期脑损伤程度及神经功能的影响脑出血术后28天,普通饮食与高胆碱饮食小鼠均有不同程度的残余病灶、脑萎缩及脑白质损伤,但脑出血28天后两组小鼠残余病灶体积、脑萎缩程度及白质损伤的比较均无统计学意义(n=8 mice/group,P值均大于0.05)。此外,脑出血术后普通饮食与高胆碱饮食小鼠均有不同程度的神经功能缺损,且两组小鼠转角试验、NDS评分总分、NDS各项得分(步态、身体对称性、自主转圈、强制转圈、攀爬实验及前肢对称性)在脑出血后各个时间点的差异性比较均无统计学意义(转角试验、NDS评分总分、步态、身体对称性、自主转圈、强制转圈、攀爬实验、前肢对称性的重复测量的方差分析检验值F分别为1.730,3.458,1.878,2.271,1.347,3.337,0.214,1.843,P 值均大于 0.05)。结论1.高胆碱饮食可显著升高假手术小鼠血清中TMAO的浓度;虽然脑出血术后高胆碱饮食小鼠血清中TMAO的浓度较假手术组有下降的趋势,但其浓度仍高于普通饮食脑出血小鼠。2.虽饮食途径诱导的高血清TMAO浓度在一定程度上有增加脑出血急性期炎症反应的作用,但其对脑出血急性期脑损伤程度、远期脑损伤程度及神经功能均无影响。