论文部分内容阅读
背景与目的:心肌纤维化是多种心血管疾病发展至终末期的共同病理表现。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(Renin-Angiotensin-Aldosteronesystem,RAAS)的激活是导致心肌纤维化的主要原因,其中血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)、醛固酮是RAAS的主要效应因子。其主要病理特征为心肌间质成纤维细胞过度增殖、迁移、胶原沉积及异常分布,目前尚无针对性且治愈率高的治疗方式。类泛素化修饰(Neddylation,NEDD)是新型翻译后修饰,需要E1激活酶(NAE)、E2结合酶(UBC12、UBE2F)、E3连接酶(十几种,其中包括DCN1)和去NEDD化酶共同作用。NEDD异常已被证实与癌症、神经退行性疾病和先天性心脏病等多种疾病密切相关。DCN1是E3连接酶的一种,DCN1在E1结合位点重叠表面直接与UBC12(E2中一个)相互作用。晶体结构分析表明,UBC12的N-末端的蛋氨酸是乙酰化的,与下游的氨基酸残基一起插入DCN1的疏水囊中,促进Cullins类泛素化修饰。DCN1-UBC12的结合可以被小分子抑制剂破坏,设计选择性抑制Cullin3的类泛素化修饰,引起底物Nrf2蓄积。DCN1-UBC12相互作用是比较有前景的研究靶点。靶向DCN1-UBC12相互作用的小分子化合物对免疫反应及炎症因子的调节作用已有报道,且已证实心肌纤维化与氧化应激炎症反应密切相关。但是靶向DCN1-UBC12相互作用抑制剂对心肌纤维化的作用及机制其尚不明确,值得进一步探讨。方法:本课题分为两个部分,首先通过主动脉弓缩窄(TAC)造成心脏压力负荷诱导心肌纤维化的发生,初步探讨DCN1的蛋白表达是否参与主动脉缩窄术(TAC)诱导心肌纤维化。其次,在本实验室前期建立稳定的DCN1-UBC12体外酶水平的筛选体系上,选出较好的靶向DCN1-UBC12小分子化合物。通过提取乳鼠心肌成纤维细胞,Ang Ⅱ诱导心肌纤维化的模型,采用分子生物学技术探究靶向DCN1-UBC12相互作用的化合物抗心肌纤维化的作用及其机制。第一部分:探讨DCN1是否参与主动脉缩窄术(TAC)诱导心肌纤维化(1)选取健康C57BL/6鼠,分为假手术组(Sham)、主动脉弓缩窄4W组(TAC4W)和主动脉弓缩窄8W组(TAC 8W)组,检测心功能,计算左室射血分数(LVEF%)、左室短轴缩短率(LVFS%)、左心室收缩后期后壁厚度(LVPWs)、左心室舒张末期后壁厚度(LVPWd)、肺重/体重(LW/BW)和肺重/胫骨长度(LW/TL)。(2)提取心脏全蛋白,Western Blot法检测α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ、DCN1、Nrf2,NQ-1蛋白表达。另一部分心脏,多聚甲醛固定,石蜡切片免疫荧光法检测DCN1蛋白表达。第二部分:探究作用于DCN1-UBC12的抑制剂抗心肌纤维化的作用及机制(1)选用出生1-3d的SD大鼠的新生乳鼠,分离、提取和培养乳鼠心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs),用Vemintin抗体通过免疫荧光鉴定细胞纯度和活性。通过MTT法、免疫荧光实验、划痕实验、Transwell实验、Western Blot检测靶向DCN1-UBC12的化合物是否有效缓解Ang Ⅱ诱导的心肌纤维化,以及相关机制通路蛋白Nrf2、NQ-1变化。(2)构建靶向干扰DCN1的si RNA,Western Blot再次检测靶向DCN1-UBC12的化合物是否有效缓解Ang Ⅱ诱导的纤维化,以及相关机制通路蛋白Nrf2、NQ-1变化。(3)细胞水平的药效学初步评价,通过Western Blot实验评价筛选出新的DCN1-UBC12的化合物和氯沙坦、DC-2(已发表的靶向DCN1-UBC12小分子化合物)、与筛选出新的DCN1-UBC12的化合物结构类似但无靶向性的阳性对照化合物对Ang Ⅱ诱导的心肌纤维化的抑制作用比较。(4)初步评价靶向DCN1-UBC12的化合物在小鼠体内安全性,采用急性毒性实验,化合物2 g/kg的DN-2与同体积玉米油为对照组,实验过程记录小鼠体重,0天和14天后检测心功能,14天后重要脏器苏木精-伊红(Hematoxylin-Esoin)染色,初步评价靶向DCN1-UBC12的化合物在小鼠体内安全性。结果:第一部分:TAC术后4W发生心肌肥厚,TAC术后8W小鼠心功能降低;DCN1的蛋白表达参与主动脉缩窄术(TAC)诱导心肌纤维化(1)小鼠行主动脉弓缩窄术后,TAC 4W组与Sham组相比,左室射血分数(LVEF%)下降24.58%,TAC 8W组与Sham组相比则下降43.60%。左室短轴缩短率(LVFS%),TAC手术8周(TAC 8W组)为19.41%,而Sham组为41.26%,指示在小鼠心功能降低。TAC 4W组的左心室收缩后期后壁厚度(LVPWs)和左心室舒张末期后壁厚度(LVPWd)显著性增高。TAC 8W的肺重/体重(LW/BW)和肺重/胫骨长度(LW/TL)的比值与Sham组比有显著增高。(2)主动脉弓缩窄术后八周(TAC 8W)与Sham组相比,小鼠心肌组织的α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ显著增加,具有统计学差异,与此同时TAC 8W组与Sham组DCN1的蛋白表达量增高1.5倍左右,且其下游调控蛋白Nrf2和NQ-1表达明显降低。第二部分:靶向DCN1-UBC12的抑制剂DN-2,通过抑制DCN1-UBC12的活性,调控Nrf2信号通路,缓解Ang Ⅱ诱导心肌纤维化心肌成纤维细胞活化、增殖、迁移以及胶原分泌。(1)分离、提取和培养的CFs,通过Vemintin抗体鉴定,细胞纯度大于95%,有良好的活性,满足实验需求。采用MTT法、免疫荧光实验、划痕实验、Transwell实验、Western Blot检测得出:AngⅡ可以诱导心肌纤维化的发生,靶向DCN1-UBC12抑制剂DN-2有效缓解AngⅡ诱导的心肌纤维化相关机制通路蛋白Nrf2、NQ-1也有相应的变化。(2)si RNA实验验证DN-2通过抑制DCN1活性,来调控Nrf2信号通路从而参与AngⅡ诱导的心肌纤维化。(3)细胞水平DN-2的活性与阳性对照药氯沙坦相媲美,比已发表DC-2小分子化合物保护纤维化作用更好。(4)在急毒实验中,化合物DN-2与对照组相比,并未引起小鼠死亡,且小鼠心功能无明显变化,重要脏器HE染色也未见不同,由此可见:化合物DN-2在动物体内有良好的安全性。结论:靶向DCN1-UBC12小分子化合物DN-2有效缓解AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞活化、增殖、迁移以及胶原分泌,其机制是DN-2通过抑制DCN1-UBC12蛋白蛋白相互作用,从而进一步调控Nrf2信号通路缓解纤维化的发生。