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研究目的和背景胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能失调是2型糖尿病发病机制中关键的两大要素。代谢压力导致了胰岛素抵抗和β细胞功能下降。早期胰岛β细胞可以通过代偿性增殖,分泌更多的胰岛素来维持血糖的稳态。但随着代谢压力的持续进展,胰岛β细胞功能发生失代偿,就会导致2型糖尿病的发生。因此,研究如何延缓代谢压力下胰岛β细胞功能的衰退,以及如何促进胰岛β细胞代偿增殖能力来应对增加的代谢压力,是寻找糖尿病治疗靶点的重要途径。过多的卡路里摄入及肥胖可增加胰岛β细胞的代谢压力,损伤胰岛β细胞功能,最终导致糖尿病的发生。而卡路里限制则可以减轻代谢压力,是预防和治疗糖尿病的重要手段。但卡路里限制后对于胰岛β细胞是否具有保护作用以及相关机制,现在还不清楚。因此我们对db/db小鼠进行卡路里限制,以明确卡路里限制是否可以保护胰岛β细胞功能并探讨相关机制,为改善代谢压力下受损的胰岛β细胞功能提供新的线索。同时,胰岛β细胞在代谢压力下代偿性增殖的机制目前并不十分明确,而葡萄糖是代谢压力下促进胰岛β细胞代偿性增殖的重要因子,本研究中我们也对葡萄糖诱导胰岛β细胞增殖的部分机制进行探讨。在本课题组前期建立的高糖灌注诱导胰岛β细胞增殖的大鼠模型中我们发现,其胰岛β细胞中WNT/β-catenin信号通路的抑制蛋白Sfrp5表达明显下降。而近来的研究发现Sfrp5参与了肥胖状态下的β细胞代偿性增殖调控。Sfrp5是否也参与了高糖条件下的β细胞增殖,目前还不清楚。我们利用持续高糖灌注的大鼠模型以及胰岛细胞株和分离的原代胰岛,对葡萄糖促进胰岛β细胞增殖的机制进行探讨,以期明确Sfrp5在高糖诱导的胰岛β细胞增殖中的作用及其相关的调节机制,从而为2型糖尿病药物靶点的发现和筛选提供新的线索和理论依据。材料与方法在卡路里限制对胰岛β细胞保护作用研究中,首先选取3周龄的雄性野生型C57小鼠12只,给予自由进食,设定为wt-al组。将3周龄的雄性db/db小鼠随机分为两组,每组各12只。其中一组db/db小鼠参照野生型小鼠的进食量,给予同等重量的饲料,设定为db-cr组。另一组db/db小鼠自由进食,设定为db-al组。每天监测三组小鼠的体重、进食量,隔天监测随机血糖,每周监测一次空腹血糖,直至小鼠9周龄时实验结束。在小鼠5、6、7、9周龄时行腹腔糖耐量实验,以观察小鼠糖耐量水平。在小鼠9周龄实验结束时,留取小鼠空腹血清测定血清胰岛素水平,留取胰腺组织测定胰岛素含量,石蜡包埋行免疫组化实验比较胰岛形态,Ki-67免疫荧光染色比较各组小鼠的β细胞增殖情况,通过免疫荧光实验来比较各组小鼠胰岛β细胞中Glut2、Pdx-1、Maf A表达情况。在Sfrp5在高糖诱导胰岛β细胞增殖中的作用研究中,我们首先利用颈静脉持续输注50%葡萄糖24小时的方法,建立高糖诱导胰岛增殖的大鼠模型,研究在体葡萄糖促进胰岛β细胞增殖时Sfrp5基因的表达情况。其次是将胰岛β细胞瘤细胞系INS-1细胞和分离的大鼠原代胰岛细胞,在体外用不同浓度的葡萄糖培养24小时,用Ed U掺入的方法检测细胞的增殖情况。同时提取RNA和蛋白,用Realtime PCR和Western Blot的方法检测Sfrp5基因的表达变化。之后通过腺病毒转染的方法,在INS-1细胞及大鼠原代胰岛细胞中高表达Sfrp5后,观察葡萄糖刺激的胰岛细胞增殖的情况。并利用双荧光素酶报告基因检测系统以及Western Blot的方法,检测WNT/β-catenin信号通路的变化情况,同时检测WNT基因下游与细胞增殖相关的基因如:Cyclin D1,Cyclin D2的表达情况。最后通过在INS-1细胞中加入PI3K抑制剂和转染持续激活型AKT质粒,研究葡萄糖调控Sfrp5表达的机制。结果1、卡路里限制的db/db小鼠较自由进食的db/db小鼠体重减轻,并伴随着空腹血糖、随机血糖、糖耐量的改善。2、卡路里限制的db/db小鼠胰腺中的胰岛素含量及Glut-2、Pdx-1、Maf A表达水平均显著高于自由进食的db/db小鼠。3、卡路里限制的db/db小鼠胰岛β细胞Ki67阳性细胞数高于自由进食的db/db小鼠。4、在高糖持续输注24小时的大鼠模型中胰岛β细胞增殖明显,胰岛中Sfrp5表达降低。5、细胞增殖检测结果提示,INS-1细胞与分离的大鼠原代胰岛细胞在16.7m M的葡萄糖作用下,Edu的掺入较5.6m M的葡萄糖增高,说明细胞增殖增加。同时Sfrp5在16.7m M葡萄糖培养条件下,无论m RNA或蛋白水平的表达均低于5.6m M的葡萄糖。6、高表达Sfrp5的INS-1细胞和大鼠原代胰岛细胞进行高糖刺激时,细胞的增殖较对照组降低,同时逆转了高糖引起的WNT/β-catenin信号通路的激活,其下游的细胞周期蛋白Cyclin D2表达增加也被抑制。7、INS-1细胞中加入PI3K抑制剂可逆转高糖引起的Sfrp5表达下调,而AKT的持续活化可引起Sfrp5表达降低。结论1、限制卡路里摄入可减轻体重,显著减轻机体的代谢压力,恢复与胰岛β细胞功能相关的关键基因如Glut-2、Pdx-1、Maf A的表达,从而改善胰岛β细胞功能。2、高糖可通过PI3K/Akt通路抑制Sfrp5的表达,进而增加Cyclin D2的表达,促进胰岛β细胞代偿性增殖。