第一部分BAP1通过组蛋白泛素化调控UM发生的作用机制研究研究目的葡萄膜黑色素瘤（Uveal Melanoma,UM）是成人最常见的原发性眼内恶性肿瘤,容易发生远处转移,严重威胁患者生命。近年来UM的发生机制研究主要围绕基因及染色体等遗传学层面,然而UM的表观遗传发病机制尚不清楚。BAP1（BRCA1 associated protein-1）和UM的发生转移密切相关,在细胞的增殖生长和周期调控中发挥着重要作用。本研究旨在辨别BAP1在UM发生中的作用机制和功能,探索BAP1调控UM细胞周期的分子机制及表观遗传学修饰,为UM的预防和治疗提供新靶点和新思路。研究内容和方法1.通过胸腺嘧啶双阻滞法进行细胞周期同步化,流式细胞仪检测细胞周期的变化,Western blot检测不同时期BAP1蛋白及细胞周期蛋白的表达水平。2.构建稳定干扰BAP1基因表达的UM细胞系,Transwell迁移实验、软琼脂克隆形成实验检测BAP1沉默后UM肿瘤学特性的改变。3.BAP1稳定敲除后,RT-PCR和Western blot检测其下游靶基因SKP2,CCNA2,CDC6,CDC25A,P107 的表达改变。4.染色体免疫共沉淀检测BAP1和细胞周期调控因子E2F1、HCF1在下游靶基因启动子区的结合以及BAP1沉默后组蛋白H2A泛素化（H2AK119ubl）的富集变化。研究结论1.细胞周期同步化检测BAP1蛋白在各个时期表达相对不变,BAP1稳定沉默后E2F1下游靶基因的表达明显下调。2.BAP1基因敲除可以导致UM细胞转移和克隆形成能力明显下降,细胞出现G1/S期阻滞。3.BAP1可以和HCF-1/E2F1形成复合物共同结合在E2F1靶基因的启动子上,HCF-1沉默明显抑制BAP1在靶基因启动子的结合。4.BAP1可以抑制下游靶基因启动子区域H2AK119ub1活性发挥基因转录激活的作用。研究成果1.发现BAP1基因在UM的发生和细胞周期调控中具有重要作用,BAP1沉默可以抑制UM的生长和转移,细胞周期发生G1/S阻滞。2.阐明了BAP1基因调控UM细胞周期变化的分子机制,BAP1通过影响E2F1下游靶基因促进细胞周期进程。3.明确了 BAP1调控下游靶基因的表观遗传修饰机制,发现BAP1可以被HCF-1/E2F1招募到下游靶基因的启动子区进而抑制H2AK119ub1活性增强基因的转录。讨论该项研究结果有助于深入理解BAP1在UM发生中的作用,对于BAP1调控UM细胞周期的分子机制及在UM发生转移中的作用有着重要的意义。第二部分长非编码RNA在UM发生中的作用机制研究研究目的葡萄膜黑色素瘤是成年人最常见的眼内恶性肿瘤,转移性强,致死率高。既往UM的研究方向主要围绕基因突变或染色体缺失等遗传学方向展开,然而UM发生中的表观遗传调控机制及相关因子尚不明确。长非编码RNA（Long noncoding RNA,LncRNA）是一个重要的表观遗传因子,在肿瘤中常发挥关键作用。本研究旨在辨别UM发生中的关键LncRNA,解析LncRNA在UM发生中的作用机制,为UM的靶向治疗提供新思路。研究内容和方法1.利用RT-PCR筛选并验证UM中特异性表达的LncRNA。2.通过稳转细胞系构建、划痕迁移实验、软琼脂克隆形成和裸鼠皮下成瘤实验检测LncRNA对UM的肿瘤学特性的影响。3.通过cDNA芯片筛选出LncRNA下游靶基因,生物信息学分析LncRNA调控下游基因的信号通路。Transwell迁移实验和软琼脂克隆形成实验探究LncRNA下游靶基因对UM肿瘤学特性的影响。4.通过染色质寡核苷酸沉淀、染色质免疫共沉淀等实验探究LncRNA对靶基因的表观遗传学调控机制。研究结论1.发现UM细胞中P2RX7-V3高表达,沉默P2RX7-V3可以抑制UM的转移和成瘤能力。cDNA芯片及生物信息学分析显示PI3K-AKT通路是P2RX7-V3的主要调控通路。2.LncRNA-891是UM中新发现的高表达LncRNA,沉默LncRNA-891可以抑制UM的转移和成瘤能力。表达谱芯片显示PCDH20是LncRNA-891的下游靶基因。过表达PCDH20可以抑制UM的生长和转移。3.LncRNA-891可以结合在PCDH20的启动子上,通过去除了组蛋白H3K4三甲基化修饰,抑制PCDH20的表达从而加剧UM肿瘤进展。研究成果1.发现了已知编码基因P2RX7转录的LncRNA-P2RX7-V3,证明了其在UM中的作用和调控模式。2.发现了一条全新的核内LncRNA-891,明确了其在UM中的促癌作用。3.将原钙黏蛋白PCDH20引入葡萄膜黑色素瘤研究中。4.发现了 LncRNA-891调控PCDH20的表观遗传学修饰机制,阐明了全新的LncRNA-调控模式。