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前言 细胞生长是生物大分子合成，导致细胞体积或质量增加。细胞生长不是简单的质量增加，而是发生在特定的时间和地点的受到精细调控的过程，并且与细胞增殖、凋亡相互协调才能长成适宜的细胞、器官或个体。近年来研究表明，雷帕霉素靶（mammalian target of rapamycin，mTOR）蛋白在细胞生长的信号转导过程中具有十分重要的作用，是细胞生长的中心调控因子。mTOR属于磷酯酰肌醇激酶相关激酶（phosphoinositide kinase-related kinases，PIKKs）家族中的新型丝/苏氨酸蛋白激酶。它的两个底物蛋白p70S6激酶(p70S6K)和起始因子4E结合蛋白1（4E-BP1）均是蛋白质合成的重要调控因子。 蛋白质合成在细胞生长中起重要作用，它受许多刺激因素的调控，包括胰岛素和佛波酯。以往有关调控蛋白质合成的信号途径的研究多集中于胰岛素。在一些细胞系中，mTOR和p70S6K受磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（PKB）的调控。PKB位于PI3K的下游，受PI3K的调控。已有研究表明，胰岛素通过PI3K、mTOR依赖性途径促进蛋白质合成。佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）是PKC的激动剂，它促进蛋白质合成，然而其信号传递途径及其与PI3K、mTOR之间的关系目前尚不清楚。LY294002是PI3K特异性抑制剂。雷帕霉素（rapamycin）是一种亲脂性大环内酯物，当它进入细胞发挥作用时，首先与其细胞内受体FK506结合蛋白（FKBP12）形成复合物，rapamycin-FKBP12复合物的细胞内靶蛋白称为mTOR（mammslian target of rapamycin）。Rapamycin能特异性抑制mTOR激酶活性。因此，本研究分别用rapamycin或LY294002预处理、PMA或胰岛素处理血清饥饿的中国仓鼠肺成纤维细胞（Chinese hamster lung cells，CHL），检测p70S6K和PKB的活性变化及其表达，探讨PMA和胰岛素在蛋白质合成中的信号传递及其与PI3K、mTOR之间的关系，为进一步研究蛋白质合成、细胞生长、增殖等领域提供理论依据。 心肌肥厚与各种心脏事件的发生密切相关，是独立的心血管病危险因素，然而其确切机制尚不清楚。目前研究认为，各种生长因子、神经递质、机械应力等刺激，通过激活细胞内信号传递途径引起的蛋白质合成增加、细胞过度生长，是高血压病发生心肌细胞肥大、心肌肥厚的主要机制。心肌肥厚的细胞学特征主要表现为:细胞体积增加、蛋白质合成增加。Rap田旧ycin通过特异性抑制mTOR激酶活性，抑制mTO形p70 s6K信号通路的激活。有研究表明，Rapamycin抑制血管紧张素n、苯肾上腺素、异丙肾上腺素、缓激肤等诱导的胎鼠心肌细胞的肥大、尹S6K的活化及蛋白质的合成等。功ToR是细胞生长的中心调控因子，p70 S6K是调控蛋白质合成的关键信号分子。因此功TO份夕“肠K信号途径可能在心肌细胞肥大、心肌肥厚的发生中起重要的调控作用。另外，饥饿培养的新生大鼠的心室肌细胞处于终末分化状态，而不重新进人细胞周期。在生长因子的刺激作用下，这些细胞只发生肥大反应而不发生细胞分裂，从而避免受到细胞周期进程的复杂影响。因此新生大鼠心室肌细胞是研究细胞生长的理想模型。 为此我们原代培养新生大鼠的心室肌细胞，应用raPamycin预处理、20%胎牛血清处理血清饥饿的心肌细胞，观察心肌细胞表面积、蛋白质含量及p70S6K的活性改变。同时选用自发性高血压大鼠（spontaneous hyperten-siverat，SHR）为实验对象，研究心肌肥厚时，形态学和血液动力学参数改变、左室心肌mTOR和p70肠K的表达及活性变化，旨在揭示mTO份p7056激酶信号通路在心肌细胞生长、心肌肥厚中的作用和机制。方法 1.细胞培养及细胞周期同步化 （l）中国苍鼠肺成纤维细胞系（CHL）由中国医科大学遗传教研室提供，用DMEM（d山eeeo，s modified Eagle，s medium）培养基加10%的56℃灭活的胎牛血清，滤膜除菌。将5 x10，细胞接种于250d培养瓶中，隔天换液。细胞长满至70%时改用不加胎牛血清的DMEM，饥饿培养18h，此时细胞同步于G0/Gl期。 （2）新生大鼠心室肌细胞（neonatal rat ventrieularm”eytes，NRVMs）的培养:取1一3d龄的SD乳鼠，无菌条件下取出心室，剪成1，大小碎块，0.25%胰蛋白酶消化，静置8一ro分钟，巧00 xg离心，去上清，收集细胞，加人含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃、5%CO:的条件下培养。将5 x10，细胞接种于250耐培养瓶中，48h后换成无血清培养液，饥饿培养48h。 2.Westem印迹分析 吸取上清，考马斯亮蓝法测定样品中蛋白浓度。用SDS一PAGE电泳分离，BIORAD电泳板，双板条件为:巧OV，30mA。然后转移到硝酸纤维素膜上，经2小时50V的转印后TTBS系膜3次，每次5分钟。用含5%BSA的TTBS封闭4℃过夜，再分别与抗p70 s6K抗体、抗mTOR抗体、抗PKB抗体（1:400）室温孵育2h，于相应的HRP标记的羊抗兔或鼠的二抗（l:5000）室温孵育lh，ECL系统显影。 3.Pvo肠K、PKB活性测定 处理后的细胞或组织，PBS洗后加人200闪细胞裂解液，成分为:含有20mmol/L Tris一HCI，pH 7.5，0.1 mmoFL Na3V04，25 nunoFL NaF，ZnunoFLEDTA，ZnunoFL EGTA，lmmoFLD，I