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肌肉型磷酸果糖激酶(phosphofructokinase-muscle,PFKM)是用于催化糖酵解过程中的6磷酸果糖不可逆地转化为1,6-双磷酸果糖的一种关键的多调控酶。前期研究中,我们通过同位素相对标记与绝对定量(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation,iTRAQ)技术从巴马猪、大白猪和姜曲海猪的肌肉组织中检测出PFKM基因表达有很大的差异,很可能PFKM通过调控细胞代谢影响肌肉发育,进而影响猪生长。为了探究猪PFKM基因对线粒体功能的影响,本研究构建猪PFKM基因CRISPR/Cas9敲除载体及过表达载体,分别获得PFKM基因敲除细胞株及PFKM基因过表达细胞株,在细胞及分子水平上测定其对线粒体功能的影响,本研究主要研究内容包括以下几部分:研究一利用CRISPR/Cas9系统构建猪PFKM基因敲除载体及基因定点突变细胞株的制备利用CRISPR/Cas9系统设计了 3条靶向切割PFKM基因的sgRNA并构建相应的PFKM-KO1、PFKM-KO2、PFKM-KO3敲除载体,转染PK15细胞,利用嘌呤霉素筛选,富集PFKM敲除细胞群,提取各组细胞DNA进行PCR扩增敲除区域,在DNA水平通过序列测定确定敲除效率。提取各组细胞RNA及总蛋白,利用qRT-PCR及Western blot测定PFKM表达水平。结果表明,各敲除组细胞PFKM DNA序列均检测到突变,PFKM mRNA及蛋白表达量均有下降,其中,pPFKM-KO2组DNA突变率最高,pPFKM-KO2 mRNA及蛋白表达量降低最多,与对照组相比差异均极显著(P<0.01)。筛选出敲除效率最高的pPFKM-KO2质粒转染猪PK15细胞并经嘌呤霉素筛选,获得单细胞克隆,提取各个细胞克隆DNA,利用PCR扩增敲除区域序列,通过序列测定确定是否敲除成功,利用qRT-PCR以及Western blot分别检测PFKM mRNA以及蛋白的表达水平。结果表明,转染CRISPR/Cas9基因敲除质粒获得的单细胞克隆中,筛选到一株细胞PFKM基因序列发生基因突变,qRT-PCR定量检测结果表明,和正常细胞相比,该细胞株PFKM mRNA表达量下降89.41%,差异极显著(P<0.01),Western blot检测结果表明,和正常细胞相比,敲除细胞株中PFKM蛋白表达下降了 81.63%,差异显著(P<0.05),上述结果表明,成功筛选到PFKM基因敲除细胞株。研究二猪PFKM基因过表达载体的构建及过表达细胞株的制备根据GeneBank网站检索到的猪PFKM cDNA基因序列,合成猪PFKM基因cDNA片段,构建相应的过表达载体pBudCE4.1-PFKM-EF1a-EGFP。转染PK15细胞后经流式细胞分选仪筛选出表达GFP的细胞,极限稀释法筛选出单细胞克隆。提取各个细胞克隆基因组DNA,利用PCR扩增GFP区域序列,经电泳及序列测定了解过表达质粒整合情况,利用qRT-PCR以及Western blot分别检测PFKM mRNA以及蛋白的表达水平。结果表明,转染PFKM基因过表达质粒筛选出的单细胞克隆中,电泳及测序结果表明有4株细胞检测到外源基因整合,qRT-PCR定量检测结果表明,和正常细胞相比,4株细胞株PFKM mRNA表达量均有上升,其中,PFKM-OE29细胞株表达量上升了17.86倍,差异极显著(P<0.01),Western Blot检测结果表明,和正常细胞相比,过表达细胞株PFKM-OE29 PFKM蛋白表达增加了 30%。上述结果表明,本研究成功获得PFKM基因过表达细胞株。研究三猪PFKM基因对细胞代谢及线粒体功能的影响以获得的猪PFKM基因敲除细胞株、PFKM基因过表达细胞株及正常细胞为研究对象,利用流式细胞术对细胞凋亡以及线粒体理化指标(ATP、ROS、膜电位、细胞周期)进行检测,借助透射电镜观察线粒体形态结构的变化,进而研究PFKM基因对细胞代谢及线粒体功能的影响。PFKM基因敲除细胞株的结果表明,和正常细胞组相比,细胞凋亡率、ATP、ROS降低,膜电位升高,细胞周期出现阻滞现象;PFKM基因过表达株的结果表明,和正常细胞组相比,细胞凋亡率升高,ROS、ATP升高,膜电位降低,细胞周期出现阻滞现象;透射电镜观察到的线粒体,和正常细胞组相比,PFKM基因敲除、过表达细胞株的线粒体数目增多并且发生肿胀及空泡化。通过制备PFKM基因敲除细胞株和PFKM基因过表达细胞株,利用流式细胞术、Western blot以及透射电镜检测PFKM基因对细胞代谢以及线粒体功能的影响。结果表明猪PFKM基因敲除在一定程度上可增强细胞抗凋亡能力,提高细胞的能量代谢效率,但对线粒体的结构及功能有一定的损伤;猪PFKM基因表达升高降低细胞抗凋亡能力和细胞能量代谢效率,线粒体的结构及功能也受到一定的损伤。本研究后续将在猪群体中进行进一步进行功能验证,筛选出调节骨骼肌发育的新靶标基因,用于优良品种猪分子鉴定及选育。