【摘 要】
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目的:在原核表达系统中进行表达纯化重组磷酸丙糖异构酶蛋白,并对该蛋白进行过敏原性鉴定。方法:①提取粉尘螨总RNA并逆转录成c DNA,RT-PCR扩增粉尘螨磷酸丙糖异构酶基因;②
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目的:在原核表达系统中进行表达纯化重组磷酸丙糖异构酶蛋白,并对该蛋白进行过敏原性鉴定。方法:①提取粉尘螨总RNA并逆转录成c DNA,RT-PCR扩增粉尘螨磷酸丙糖异构酶基因;②将上述PCR产物与p UC57连接后,热转化至E.coli Top10中,涂布于含氨苄霉素(100 mg/L)的LB平板上,37℃培养过夜后从LB平板上挑选白色菌落放入LB培养液中扩大培养,提取质粒。用Eco R I和Bam H I双酶切鉴定质粒,公司测序正确后进一步将酶切产物与p ET-32a表达载体连接转化至E.coli BL21;③利用生物学软件进行磷酸丙糖异构酶生物信息学分析,根据软件分析计算所得的数据构造进化树;④IPTG诱导重组菌株表达;产物经变性、复性、Ni-NTA螯合层析和Superdex75凝胶过滤层析纯化;用Western blotting实验检测重组磷酸丙糖异构酶的免疫原性;⑤收集4份来自广州医学院附属医院临床皮试的粉尘螨过敏患者阳性血清和2份健康体检者血清样本,用Western blotting、ELISA实验验证重组蛋白的过敏原性。进一步将重组磷酸丙糖异构酶蛋白进行人体皮肤点刺实验,检测44例人体皮肤点刺中磷酸丙糖异构酶蛋白的阳性率。结果:①结果成功构建重组的克隆载体和表达载体,PCR结果表明在预期位置出现与预期大小相一致特异性条带。②生物学软件分析磷酸丙糖异构酶是氨基酸数为247,分子质量为27134的疏水性蛋白。③SDS-PAGE结果显示,重组磷酸丙糖异构酶蛋白以包涵体的形式在原核生物体系中大量表达,复性纯化后的重组磷酸丙糖异构酶纯度较高,且重组蛋白能够与抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合。④Western blotting、ELISA结果显示,重组磷酸丙糖异构酶与4例粉尘螨过敏患者血清呈强阳性反应,2例健康对照组均为阴性。⑤人体皮肤点刺实验结果显示,粉尘螨提取物人体皮肤点刺44例受试者中16例磷酸丙糖异构酶蛋白呈阳性。结论:成功克隆并原核表达粉尘螨磷酸丙糖异构酶,重组的粉尘螨磷酸丙糖异构酶具有较强的过敏原性。
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