大豆是最重要的豆科植物,也是最重要的粮食作物之一。大豆能够与固氮细菌形成一种互利的共生关系,利用好大豆根瘤固氮特性,不仅能提高大豆产量,而且能减少化肥的使用,有利于农业可持续发展。大豆种植过程中由于环境压力会导致根瘤过早衰老等问题影响产量,如何延缓根瘤衰老是科研与生产的重要课题。目前关于半胱氨酸蛋白酶与根瘤衰老的研究越来越多,半胱氨酸蛋白酶参与根瘤发育和衰老也已得到验证。近年来,通过RNA-seq技术发现有18个半胱氨酸蛋白酶基因在大豆根瘤成熟及衰老期表达,但还没有明确其中有多少或哪些与根瘤衰老相关。以此为背景和前提,本研究以大豆根瘤特异表达的半胱氨酸蛋白酶为研究对象,探索其中参与大豆根瘤衰老的部分,旨在为延迟大豆根瘤衰老、提高固氮效率提供科学依据和材料。主要研究成果如下:1.通过CRISPR-Cas9系统编辑大豆结瘤因子受体基因,使大豆转基因根无法正常结瘤,完善大豆毛根转化体系的同时也成功得在大豆毛根转化体系中利用CRISPR-Cas9系统敲除基因。2.将大豆根瘤特异表达的半胱氨酸蛋白酶基因分别命名为Gm NCP1～18。通过同源性分析将其分为三组,构建CRISPR-Cas9系统敲除三组基因的载体,分别命名为CRISPR A、CRISPR B和CRISPR C。毛根转化后通过观察根瘤表型与测定根瘤固氮酶活性,表明CRISPR B能延缓根瘤的衰老。3.将CRISPR B中涉及的基因分为三部分,同样构建CRISPR-Cas9系统敲除三部分基因载体。毛根转化表型表明敲除Gm NCP3基因能延缓根瘤的衰老。4.将Gm NCP3,6,10,11,12等基因在蒺藜苜蓿中异源表达,毛根转化结果表明,只有Gm NCP3与Gm NCP11能造成苜蓿根瘤的提前衰老。5.通过酵母双杂交系统探究GmNCP1～18这18个基因表达的全部蛋白与大豆根瘤特异表达的七个半胱氨酸蛋白酶抑制剂（分别命名为Gm Cys1～7）蛋白之间的互作关系,结果表明,只有Gm NCP16基因表达的两个蛋白（Gm NCP16.1和Gm NCP16.2）能分别与Gm Cys1和Gm Cys2两个蛋白在酵母中验证为互作关系。