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肾缺血再灌注损伤（Renal ischemia reperfusion injury,RIRI）是临床治疗过程中一种常见的病理生理反应,多见于肾脏移植或急性肾动脉阻断等治疗过程中。RIRI也是导致肾移植病人术后功能恢复延迟,甚至发生急性肾功能衰竭增加患者死亡率的重要因素。研究发现:在到达肾脏的血流被暂时性阻断,随后又恢复其血液供应重新充氧的过程中,会有大量的活性氧族（reac-tive oxygen species,ROS）产生,导致肾脏处于高度氧化应激状态。这也是引发缺血再灌注损伤的重要机制之一。ROS的成员主要包括超氧阴离子（O2-）、羟自由基（OH-）和过氧化氢（H2O2）等。ROS的化学性质非常活泼,可以与细胞内的功能蛋白质、DNA和胞膜上的脂类等生物大分子发生过氧化反应,促进细胞凋亡和死亡,加剧肾脏组织损伤。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutases,SOD）是机体内一种重要的抗氧化酶,负责清除O2-,它能通过歧化反应将O2-转化成氧,但同时也产生了副产品H2O2。SOD在机体清除ROS的抗氧化应激反应中具有重要作用。在哺乳动物体内SOD共有三种亚型:锰-SOD（Mn-SOD）存在于线粒体,铜锌-SOD（Cu/Zn-SOD）主要位于细胞质和细胞核。细胞外超氧化物歧化酶（extracellular SOD,EC-SOD）是唯一位于细胞外的SOD亚型,并通过其肝素结合结构域（heparin-binding domain,HBD）与细胞表面和细胞外基质相结合。其次,EC-SOD也存在于细胞外液,如血清,脑脊髓液,腹水和滑膜液等。以往对于SOD的功能研究主要集中在Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的抗氧化作用。但最近的研究表明EC-SOD可能具有更强的抗氧化应激和抗炎作用。EC-SOD在肾脏缺血再灌注损伤模型的表达如何变化,是否也发挥了抗氧化作用,有待研究。本研究采用无损伤动脉夹钳夹肾动脉法建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型。再灌注24小时后观察肾组织内H2O2含量、MDA含量,以及抗氧化酶EC-SOD基因水平和蛋白水平的表达变化,进一步证实肾脏缺血再灌注损伤的氧化应激机制,以及EC-SOD在缺血再灌注损伤过程中的抗氧化作用,为防治肾缺血再灌注损伤提供一条新思路。目的:观察大鼠肾脏缺血再灌注损伤发生后肾脏内的氧化应激水平,以及抗氧化酶EC-SOD的基因水平和蛋白水平的表达变化,进一步证实肾脏缺血再灌注损伤的氧化应激机制,以及抗氧化酶EC-SOD在此过程中可能发挥的抗氧化作用。方法:1肾脏缺血再灌注损伤模型的制备及取材雄性wister大鼠12只,体重200±10g,购于河北医科大学实验动物中心,随机分为对照组（control）和肾脏缺血再灌注损伤组（riri）,每组各6只。用6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（5ml/kg）,参照余晓东等人的方法制备肾脏缺血再灌注损伤模型。riri组大鼠开腹后暴露其双侧肾脏,先切除右肾,然后钝性分离左肾动脉,在靠近肾门处用无创动脉夹夹闭左肾动脉,观察肾脏由鲜红色逐渐变为暗红色。45mins后松开动脉夹,恢复血液供应,肉眼可见肾动脉充盈,肾脏由暗红色迅速变为鲜红色,表明再灌注成功。对照组大鼠开腹后只切除右肾,分离左肾动脉,但不夹闭左肾动脉。24小时后收集血液,3000rpm离心10min,分离血清用于肌酐（serumcreatinine,scr）、血尿素氮（bloodureanitrogen,bun）浓度测定;处死大鼠取肾脏,将一部分肾脏于4%多聚甲醛中固定进行he染色,观察肾脏的形态学改变。将另一部分肾脏置于液氮中用于EC-SODmrna和蛋白水平测定以及丙二醛（malondialdehyde,mda）和H2O2含量测定。2测定指标及方法2.1血清scr和bun水平测定血清scr浓度采用苦味酸法测定;血清bun浓度采用酶偶联速率法测定。2.2he染色观察大鼠肾脏的形态结构肾脏组织经常规脱水、透明,石蜡包埋后,切片厚约5μm,苏木精伊红染色,日本产olympus光学显微镜下观察肾脏的形态变化并进行图象分析。2.3大鼠肾组织mda含量测定将从-70℃冰箱中取出的肾组织按照10mg/100μl加入预冷的匀浆缓冲液（50mmol/l磷酸钾缓冲液,ph7.4,1mmol/l盐酸苯甲脒,1mmol/lpmsf,0.1%tween-20,0.5mol/lnacl,1mmol/ledtana3,5mmol/lβ-巯基乙醇）,冰浴中匀浆,匀浆液4000rpm4℃离心20min,取上清即制成10%肾组织匀浆,匀浆内mda含量采用南京建成丙二醛（mda）测定试剂盒测定。2.4大鼠肾组织H2O2含量测定将从-70℃冰箱中取出的肾组织按照10mg/100μl加入预冷的匀浆缓冲液（50mmol/l磷酸钾缓冲液,ph7.4,1mmol/l盐酸苯甲脒,1mmol/lpmsf,0.1%tween-20,0.5mol/lnacl,1mmol/ledtana3,5mmol/lβ-巯基乙醇）,冰浴中匀浆,匀浆液4000rpm4℃离心20min,取上清即制成10%肾组织匀浆。匀浆内H2O2含量采用钼酸比色法测定,以每克样本蛋白所含的过氧化氢的量（mmol/gpro）表示。2.5大鼠肾组织EC-SODmrna水平测定用trizol法提取肾组织总rna。约3μg总rna反转录成cdna。以gapdh为内对照,进行rt-pcr。分别以EC-SOD的扩增产物与gapdh灰度值之比表示目的基因的相对表达量2.6大鼠肾组织EC-SOD蛋白水平测定采用westernblot法测定大鼠肾组织内抗氧化酶EC-SOD的蛋白表达水平。将大鼠肾组织制成匀浆,离心后取上清。采用改良lowry法测定其蛋白总量.电泳的蛋白上样量为63ug.经过转膜及封闭处理后,在pvdf膜上加入兔抗EC-SOD抗体,室温静置过夜。经洗膜后再加入荧光标记的抗兔igg二抗。经双色红外线成像系统扫描照相并进行图像数值分析。结果:1大鼠肾组织的形态学改变光学显微镜下可见正常组大鼠肾血管球、肾小囊、近曲、远曲小管及集合管形态结构清晰规整。而riri组大鼠可见肾血管球萎缩,体积变小;肾小囊腔扩张;肾小管管腔明显扩张,个别近曲小管上皮细胞水肿,胞浆疏松化;肾间质水肿,肾小管间隙扩大;集合管出现管腔扩张、上皮水肿等改变。2血清scr水平con组大鼠血清中scr的浓度为103.444±8.465μmol/l,而riri组血清scr的浓度为131.153±17.814μmol/l。riri组大鼠血清scr浓度明显高于con组（p<0.05）。3血清bun水平con组大鼠血清bun的浓度为4.462±0.541mmol/l,而riri组血清bun的浓度为13.685±4.397mmol/l。riri组大鼠血清bun的浓度明显高于con组（p<0.05）。4肾组织匀浆内mda的含量con组大鼠肾组织匀浆内的mda含量为9.15±1.53mmol/g,而riri组肾组织匀浆内的mda含量为12.92±2.43mmol/g。riri组大鼠肾组织匀浆内的mda含量明显高于con组（p<0.01）。5大鼠肾组织匀浆内H2O2的含量con组大鼠肾组织匀浆内的H2O2含量为11.92±1.9mmol/g,而riri组肾组织匀浆内的H2O2含量为16.62±2.35mmol/g。riri组大鼠肾组织匀浆内的H2O2含量明显高于con组（p<0.01）。6大鼠肾组织EC-SODmrna的相对表达量采用rt-pcr的方法测定大鼠肾组织内EC-SODmrna的相对表达量。con组大鼠肾组织内EC-SODmrna的相对表达量为0.67±0.12,riri组肾组织内EC-SODmrna的相对表达量为0.94±0.17,riri组大鼠肾组织内EC-SODmrna水平明显高于con组（p<0.01）。说明riri组大鼠肾组织内EC-SOD的基因表达水平升高。7大鼠肾组织EC-SOD蛋白水平con组大鼠肾组织内EC-SOD的蛋白表达水平为0.51±0.09,riri组大鼠肾组织内EC-SOD的蛋白表达水平为0.81±0.15。riri组EC-SOD蛋白水平明显高于对照组（p<0.01）。说明riri组大鼠肾组织内EC-SOD的蛋白表达水平升高。结论:1切除右肾后在靠近肾门处用无创动脉夹夹闭左肾动脉可成功建立大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型。2肾脏缺血再灌注损伤发生后,肾脏处于高度氧化应激状态,并已遭受过氧化损伤。3EC-SOD的基因和蛋白表达水平在riri模型组肾组织内均明显增强。表明EC-SOD可能参与了riri所诱发的氧化应激反应,在肾组织内发挥了抗氧化作用。