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目的:肺癌是当今世界发病率和死亡率均较高的癌症,是最常见的恶性肿瘤,已成为严重危害人类健康和生命的重要疾病之一[1]。近年来尽管肺癌发病率有所下降,但死亡率仍持续上升且5年预后生存率仅17%[2,3]。大多数病人在确诊肺癌时已是晚期,因此早期筛查、早诊断、早发现和早预防成为肺癌预防和治疗的有效措施[4]。组蛋白甲基转移酶(HTMs),在肺癌的发生发展中扮演重要的角色,可招募染色质重塑、组蛋白修饰酶控制基因和蛋白表达以及结构改造[5]。组蛋白甲基转移酶的催化了一些抑癌基因以及促癌基因发生甲基化,促进基因沉默或者过表达,导致癌症的萌芽[6]。因此,有人提出控制甲基化是对抗癌症的前提[71。山奈酚是一种黄酮醇类化合物,存在于多种天然植物和瓜果蔬菜。研究证明山奈酚可以促进正常细胞的再生和发育,使得细胞免受外来侵扰,具有良好的抗氧化、抗炎、抗病毒、抗菌以及抗肿瘤等药理活性[8]。体外研究证明山奈酚可调节包括肺癌在 内 的 多种肿 瘤细胞 中 P16 和 MGMT(O^6-methylguanine-DNA methyhransferase)等抑癌基因的甲基化,恢复其活性,阻止癌症的进一步恶化[9]。也有研究证明山奈酚可以促进肿瘤细胞凋亡、抑制增殖、炎症和侵袭转移且与甲基化程度相关[10.11]。但是,鲜有报道山奈酚在组蛋白甲基转移酶方面的研究,而这一研究正是控制癌症不可缺少的部分[5]。基于目前研究现状,本文将采用肺癌细胞模型以及小鼠移植瘤模型评价山奈酚通过抑制SET7/9表达而对抗肺癌的作用及机制。方法:1.比较分析肺腺癌中SET赖氨酸甲基转移酶利用在线数据库(http://www.oncolnc.org/search_results/)分析来源于 TCGA数据库中491例肺腺癌病例SET和SET7/9基因的生存分析。采用Real-time qPCR和Western blot方法考察乌拉坦诱导的FVB小鼠、苯并芘诱导的A/J小鼠、裸鼠肺实体瘤组织以及癌旁组织,人肺癌细胞(A549、NCI-H1299、H1975、H1650、1-I1819)和人正常肺支气管上皮细胞(BEAS-2B)中SET家族和SET7/9基因和蛋白表达。2.考察山奈酚对肺腺癌细胞SET基因和蛋白家族表达水平以 MTT 法考察山奈酚对 A549、NCI-H 1299(0-80μM)和 BEAS-2B(0-50 μM)细胞诱导48 h或5 d的细胞活力的影响。以A549和NCI-H1299作为体外研究模型,经山奈酚(5,10,20 μM)、阳性药 5-aza(5-azacytidine)(2.5 μM)/TSA(Trichostatin A)(500 nM)给药 5 天后,并通过 Real-time qPCR 和 Western blot技术检测SET以及SET7/9基因和蛋白家族表达水平。3.评价山奈酚对SET7/9的靶向作用采用Docking(计算机模拟)、细胞热转移法(CETSA)和共定位的方法,考察SET7/9是否为山奈酚的靶点?以Docking 4.2版模拟山奈酚对SET7/9亲和性。通过细胞热转移法(CETSA)实验,以山奈酚(100 μM)与A549细胞裂解液体外常温孵育30 min,在44-54℃下加热后进行Western blot分析;再于山奈酚50-800 μM共孵育后于50℃下加热后,检测其蛋白表达情况。共定位分析则用山奈酚诱导细胞6 h后,伴随一抗二抗结合,采用激光共聚焦显微镜进行图像捕获,后进行分析。在A549细胞中,经山奈酚、5-aza/TSA给药5天后,应用Western blot 考察 PP2Ac、p-AKT、p-GSK-3β蛋白表达。在A549细胞中,通过siRNA和过表达方法,采用Lipofectamine TM 2000为转染试剂转染12 h后,继续给予山奈酚孵育48 h后检测其基因和蛋白表达,以及SET7/9下游PP2Ac和Cytochrome C的影响。过表达则应用BEAS-2B细胞进行质粒转染pEX-4,后检测其PP2Ac和Cytochrome C的蛋白表达。在A549细胞沉默和BEAS-2B细胞过表达SET7/9后,通过EdU实验,考察山奈酚对细胞增殖能力的影响。4.考察山奈酚对线粒体凋亡的影响经山奈酚或者5-aza与细胞体外孵育6h后,应用免疫荧光法考察山奈酚与线粒体的结合情况。继续应用罗丹明123荧光法考察山奈酚对细胞中线粒体膜电位的变化、Cytochrome C和caspase 9蛋白表达。5.山奈酚体内抗肿瘤作用研究及相关机制验证于雌性裸鼠皮下接瘤A549-1uc-C8荧光细胞,待肿瘤长至50-1003 mm后开始给药,给药时间为30天,每周给药5天。给药结束后剥离肿瘤和脏器指数并统计。再通过Real-time qPCR、免疫组化及Western blot检测肿瘤组织中SET7/9、PP2Ac和Cytochrome C的基因或蛋白表达。6.统计学分析采用SPSS 19.0统计软件进行数据统计分析,两组间比较采用独立样品t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析ANOVA,p<0.05表示具有统计学差异。统计结果以Mean土 SD表示,采用GraphPad Prism 5.0软件作图。结果:1.肺腺癌中SET基因和蛋白家族显著高于癌旁生存分析结果表明SET和SET7/9均为表达低的预后良好。通过比较肺癌组织、肺腺癌细胞以及正常细胞中SET家族本底表达,得出FVB和裸鼠肺癌组织中SET7/9基因和蛋白表达显著高于癌旁组织;A549细胞中SET家族蛋白显著高于BEAS-2B细胞。2.山奈酚显著抑制肺腺癌细胞中SET基因和蛋白家族表达MTT结果表明,山奈酚低浓度对A549和H1299细胞均表现出显著的抑制作用。进而确定山奈酚给药浓度为5,10,20 μM。经山奈酚给药5天后,Real-time qPCR和Western blot结果表明,10或20 山奈酚对SET家族基因和蛋白表达具有显著的抑制作用,尤其是SET7/9,且抑制效果具有浓度依耐性。3.山奈酚选择性地抑制SET7/9Docking模拟表明山奈酚与SET7/9的亲和性良好。其结合能量为-9.55 kcal/mol,Ki值为99.86 nM。细胞热转移法(CETSA)实验证明随着温度的上升,山奈酚的灰度值下降程度显著低于对照组;在50℃下,随着山奈酚浓度的上升,其灰度值达到最高后会保持不变,证明山奈酚与SET7/9结合能力较好。共定位分析也表明山奈酚与SET7/9直接结合。山奈酚显著上调PP2Ac、p-AKT、p-GSK-3β的蛋白表达,激活此通路。在A549细胞中,将SET7/9沉默以后,其作用下游PP2Ac以及Cytochrome C蛋白表达均无显著变化。同时,EdU实验结果表明细胞增殖无显著变化。而在BEAS-2B细胞过表达SET7/9后,其下游PP2Ac以及Cytochrome C显著的下调。且细胞增殖被显著抑制。沉默和过表达实验结果证明了山奈酚仅通过SET7/9抑制肺癌细胞增殖,引起线粒体凋亡。4.山奈酚诱导线粒体凋亡山奈酚通过直接作用于线粒体促进线粒体膜电位升高,Cytochrome C和caspase 9蛋白表达分别上调8.25和3.35倍,促进肺癌细胞的凋亡。5.山奈酚在体内抑制SET7/9对抗肺癌的机制及验证裸鼠移植瘤实验证明,山奈酚显著的减小肿瘤大小。与模型组相比,山奈酚75、150 mg/kg均能显著的减小肿瘤的体积和重量;免疫组化或Western blot结果表明,山奈酚降低肿瘤组织中SET7/9蛋白表达1.67倍,上调Cytochrome C蛋白表达3.10倍。与control组相比,山奈酚给药组对裸鼠重量无影响。提示山奈酚在体内几乎没有毒性且具有显著的抵抗肺癌发展。结论:本文探索山奈酚抑制SET7/9抗肺癌作用及机制,结果表明山奈酚通过选择性的靶向抑制SET7/9,激活PP2Ac-AKT-GSK-3β信号通路,进而增加线粒体膜电位,促进Cytochrome C从线粒体中释放,导致线粒体凋亡。因此,本研究可为山奈酚成为一种潜在的SET7/9抑制剂对抗肺癌提供一定的理论依据。