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骨肉瘤是青少年最常见的骨原发性恶性肿瘤,恶性程度高,极易发生肺转移,骨肉瘤传统治疗方法包括术前化疗、手术切除原发灶和转移灶、术后化疗及放疗,因化疗耐药总体疗效并不理想。近年来研究发现骨肉瘤干细胞（Osteosarcoma Stem Cell,OSC）的存在是骨肉瘤发生复发、肺部或其他骨骼转移的主要原因。把OSC作为治疗靶细胞,为儿童骨肉瘤治疗提供了新方法。近些年来国外学者研究发现白介素-24（Interleukin-24,IL-24）是一种肿瘤抑制基因,又称为黑色素瘤分化相关基因,不仅可以抑制肿瘤生长,还具有诱导细胞凋亡的广谱抗肿瘤作用。国内外研究证实在血液系统中白血病细胞由于IL-24诱导可以分化成为成熟单核-巨噬系细胞。目前IL-24对肿瘤干细胞的生物学行为影响尚未见报道。因此,本课题拟研究重组人IL-24（Recombinant Human IL-24,rhIL-24）蛋白对OSC生物学行为的影响。目的:一、利用人IL-24的cDNA构建原核表达质粒pET32a-IL-24,通过重组质粒感染大肠杆菌BL21（DE3）菌株,获得重组蛋白IL-24后对其进行鉴定、纯化、复性。二、通过无血清悬浮培养和免疫磁珠分选相结合的方法,培养并分选人骨肉瘤143-B细胞系中骨肉瘤干细胞。三、研究rhIL-24对CD133+的骨肉瘤干细胞生物学行为的影响。方法:一、利用分子生物学和免疫学技术,将人源IL-24的cDNA插入到表达质粒pET32a（+）,构建重组质粒pET32a-IL-24,并酶切、测序鉴定。正确的重组质粒pET32a-IL-24扩增纯化后转化表达菌株BL21（DE3）,进行rhIL-24蛋白表达,并利用SDS-PAGE电泳和Western Blotting鉴定目蛋白的表达。诱导培养重组工程菌获得无蛋白活性的rhIL-24蛋白包涵体。包涵体洗涤后利用目的蛋白携带的特异性6×His纯化标签,采用镍离子亲合层析对rhIL-24蛋白纯化。经过透析使rhIL-24蛋白正确折叠达到蛋白质复性。二、在含有多种生长因子的无血清培养基中接种143-B细胞,通过悬浮培养法得到具有多数骨肉瘤干细胞的细胞球。在骨肉瘤干细胞球上的CD133表达通过细胞免疫荧光检测。从干细胞球中分离骨肉瘤干细胞,运用CD133标记的免疫磁珠分选法对进行分选和纯骨肉瘤干细胞。通过细胞单克隆形成率实验和MTT法检测分选出的CD133阳性的骨肉瘤干细胞的增殖能力。三、利用MTT实验检测经rhIL-24蛋白治疗后CD133+骨肉瘤干细胞的增殖活性;通过观察细胞形态变化了解rhIL-24对CD133+骨肉瘤干细胞分化的作用;流式细胞分析检测rhIL-24影响CD133+骨肉瘤干细胞中CD133表达情况;Transwell小室侵袭试验检测rhIL-24对CD133+骨肉瘤干细胞的侵袭能力的影响;裸鼠移植瘤成瘤实验,观察rhIL-24治疗后的CD133+骨肉瘤干细胞细胞克隆形成能力。结果:一、成功构建IL-24表达重组质粒pET32a-IL-24,结果显示,IL-24序列与Genebank（NCBI Reference Sequence:NG029565.1）的序列完全一致。重组质粒pET32a-IL-24感染表达菌株并诱导培养,总蛋白通过菌体裂解后获得,经SDS-PAGE电泳结合考马斯亮蓝染色后,在菌体总蛋白中表达的rhIL-24蛋白为39.68%,而且包涵体是rhIL-24蛋白的主要表达形式。洗涤溶解包涵体后采用镍离子亲合层析获得rhIL-24蛋白,纯度达95%以上的,并层析复性。复性后的rhIL-24蛋白冷冻抽干后-80℃保存。二、143-B细胞在含血清的完全培养基中呈贴壁生长,增殖活跃。传代后的143-B细胞接种于含多种生长因子的无血清培养基,镜下观察24小时内多数细胞贴壁生长,少数细胞以单细胞悬浮;还有部分细胞发生非特异凝聚。经过48小时培养后形成小细胞球,在培养基中悬浮,细胞球随着培养时间的延长而逐渐增大,形成明显的骨肉瘤干细胞球。细胞免疫荧光检测可见骨肉瘤干细胞球上高表达CD133。通过免疫磁珠方法分选和纯化CD133阳性细胞,骨肉瘤干细胞球中的细胞经分选后通过流式细胞仪检测发行CD133+细胞比例较高可达到96.91%。MTT检测显示CD133+细胞增殖能力显著强于CD133-细胞;而且CD133+细胞单克隆形成率高,对于CD133-细胞而言几乎不能形成典型的单克隆骨肉瘤干细胞球。三、MTT实验结果表明CD133+骨肉瘤干细胞被rhIL-24蛋白诱导后增殖被显著抑制。经培养的CD133+骨肉瘤干细胞被rhIL-24诱导在含有多种生长因子的无血清培养液中培养7天后,细胞出现突起增多、形态多样化,肿瘤干细胞标志物CD133表达显著下降,但不会完全消失,说明部分骨肉瘤干细胞未分化完全,细胞不能终末分化。侵袭试验结果显示显著降低rhIL-24对CD133+骨肉瘤干细胞的侵袭能力;在裸鼠移植瘤成瘤实验中,CD133+骨肉瘤干细胞经rhIL-24诱导后发现裸鼠中的成瘤能力明显下降。结论:一、有活性的rhIL-24蛋白通过分子生物学技术和蛋白重组技术成功获得,为下一步实验奠定基础。二、143-B细胞经含有生长因子的无血清培养液悬浮培养后形成典型的骨肉瘤干细胞球,高纯度的CD133+骨肉瘤干细胞需要利用免疫磁珠分选技术获得。三、rhIL-24蛋白能够抑制骨肉瘤干细胞的增殖,降低骨肉瘤干细胞中干细胞标志物的表达,诱导骨肉瘤干细胞分化,降低骨肉瘤干细胞侵袭和成瘤能力。综上所述,IL-24对骨肉瘤干细胞的增殖、分化和侵袭起着重要作用,为IL-24治疗骨肉瘤提供新思路和方法。