蛋白质翻译后修饰（Posttranslational modification,PTM）种类繁多,在调控酶的作用下动态变化,参与各种生理病理过程的调控,具有极为重要的生物学意义。近年来,赖氨酸新修饰的发现引起人们的密切关注,其中赖氨酸-2-羟基异丁酰化（Khib）是最近报道的一种组蛋白新型酰化修饰,研究表明该修饰在人源组蛋白上的发生能够调控基因转录,在酵母组蛋白上的发生与葡萄糖稳态相关,暗示了Khib在真核生物中重要的功能。然而该修饰在原核生物中是否有存在?以及其生物学功能和对原核生物的影响都尚不清楚。基于此,本论文从Khib在原核生物中的发现、分布规律、生物功能和调节机制等方面进行了系统研究。首先,通过免疫印迹实验发现了Khib在包括大肠杆菌（E.coli）和奇异变形杆菌（P.mirabilis）的原核生物中的存在。然后,通过亲和富集和基于质谱的蛋白质组学技术在P.mirabilis的1051个蛋白上鉴定到4735个修饰位点,并结合生物信息学解析了Khib的分布规律、组学特征、分子网络和通路,这是第一次在原核生物中对Khib的发现和系统表征。进一步研究表明,Khib分布广泛,且很多定位于重要的蛋白功能区域,预示其对底物蛋白的调控潜力。这其中,代谢调控酶上的Khib最为丰富,通过体外和体内实验,我们证明了代谢酶烯醇化酶（ENO）的K343位点,以及二磷酸甘油酸变位酶（GPMA）的K18位点的2-羟基异丁酰化修饰的发生降低了代谢酶自身活性,并且通过分子对接的方法,证明了由于修饰的发生会使得底物分子2-磷酸苷油酸（2PG）远离代谢酶（ENO和GPMA）的活性中心,造成蛋白酶与底物之间结合的改变,从而阐述了Khib影响代谢酶活性的分子机制。同时我们也证明了不同的碳源代谢能够调控体内Khib的水平。至此我们的研究表明该修饰的发生依赖于代谢,同时又对细胞代谢具有调控功能。为了进一步揭示Khib的调控机制,我们开展了Khib去修饰酶的研究。首先,采用我们最近研发的“基于多价态亲和光交联赖氨酸修饰结合蛋白分析新方法”,并联合定量蛋白质组学技术,发现了Khib的特异性结合蛋白,并从中筛选出Cob B作为潜在的去修饰酶。接下来我们分别构建了过表达和敲除Cob B的细菌体系,结合免疫印迹实验从体内水平证明了Cob B在细菌体内具有去除Khib的能力;同时,我们通过体外实验,在蛋白和多肽水平上,证明了Cob B可以去除Khib的能力,深入研究了其活性位点、辅酶、去修饰酶抑制剂的影响,并从热力学和动力学角度表征了酶活性质,从而首次发现并证明了原核生物的Khib的去修饰酶Cob B。在此基础上,我们发现了Cob B的R58是其发挥去除Khib活性的关键位点。进一步,借助定量蛋白质组学方法,研究了Cob B体内靶向的Khib位点和分子网络,在定量的5799位点中揭示了99个显著调控位点。最后,通过一系列生化和分子生物学实验,我们证明了在菌体内Cob B通过去除代谢酶ENO-K343hib使得ENO活性增强,进而改变代谢,影响细菌生长的分子机制。在修饰酶方面,通过结构分析和酶活预测,我们构建了E.coli中18个GNAT家族的乙酰化转移酶的过表达体系,结合免疫印迹实验来初步筛选Khib的修饰酶。通过实验筛选出Ypfi作为Khib的潜在修饰酶,并通过Ypfi敲除体系进行了验证。接下来我们通体外实验进行蛋白水平修饰反应,并结合免疫印迹实验进一步验证了Ypfi的Khib修饰酶活性。借助定量蛋白质组学方法,研究了Ypfi体内靶向的Khib位点和分子网络,在定量的4351个Khib位点中揭示了467个显著调控位点。在体外实验中,我们还发现Ypfi的Khib修饰酶功能依赖于ATP,且R319位点影响Ypfi同ATP结合,进而影响Ypfi的修饰酶活性。结合蛋白的定点突变实验我们发现,Ypfi能够特异性地催化E.coli中的关键类组蛋白H-NS的K121位点发生2-羟基异丁酰化。同时通过EMSA实验我们发现H-NS K121位点的2-羟基异丁酰化修饰能够影响H-NS与DNA的结合。进一步,通过Ypfi与H-NS反应后的EMSA实验,我们证明了Ypfi能够在体外水平介导H-NS K121位点2-羟基异丁酰化的发生来影响H-NS与DNA结合的分子机制。总之,本论文运用蛋白质组学方法和生化手段,首次在原核生物中发现了Khib,表征了其分布特征、鉴定并验证了其修饰酶和去修饰酶,解析了该修饰对原核细胞代谢和转录的调控功能。