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目的:研究显示骨肉瘤的发生与间充质来源干细胞“增殖与分化失衡”密切相关,即存在“抗分化”学说,但具体发生机制尚未完全明确。小调控RNA是长度较短的起重要调控作用的RNA,是生命活动的重要调节因子,参与间充质干细胞的成骨分化调控。骨形态发生蛋白9（BMP9）是属于TGF-β家族的多功能生长因子,在体内和体外具有极强的诱导间充质干细胞成骨分化能力。前期课题组自主构建了双向表达19个随机碱基（N19）的小调控RNA文库。为模拟间充质干细胞体内“增殖与分化失衡”介导骨肉瘤的发生过程,我们利用N19小调控RNA文库靶向全转录本在体外及裸鼠体内筛选间充质干细胞抗BMP9诱导成骨分化的细胞表型,明确介导抗成骨分化的单个N19小调控RNA,并阐明小调控RNA抗成骨分化的分子机制,为进一步研究骨肉瘤发生机制奠定实验基础。方法:（1）以课题组前期构建的N19小调控RNA文库为基础,经逆转录病毒包装后感染i MEF细胞,建立N19小调控RNA文库稳定表达细胞模型,同时,利用BMP9腺病毒（Ad BMP9）刺激诱导间充质干细胞成骨分化,在裸鼠体内筛选其抗成骨分化细胞表型,获得抗分化细胞模型。（2）借助DNA高通量测序技术以及生物信息学分析,我们寻找在抗成骨分化细胞中不断富集的N19小调控RNA序列（DON）;同时,在i MEF、原代MEF、i BMSC等间充质干细胞中鉴定富集的DON体内、体外介导抗成骨分化能力,并明确抗成骨分化能力最强的DON序列。（3）机制上借助DNA全外显子测序技术检测抗成骨分化细胞中的基因外显子突变,生物信息学分析在多轮体内筛选过程中呈趋势性富集的SNV,并通过功能实验,阐明在抗成骨分化细胞中富集的SNV是mi RNA的潜在结合位点。（4）以构建si RNA在细胞中稳定表达工具为例,探索多个小调控RNA同时在细胞中稳定表达策略。（5）以质粒DNA纯化为例,探索提高质粒DNA在细胞中表达效率的方法。（6）以mi RNA表达谱检测为例,探索小RNA（尤其是低丰度的小RNA）的富集及检测方法。结果:（1）我们以i MEF细胞为基础,成功构建了N19小调控RNA文库稳定表达细胞模型i MEFn19;同时,经过4轮体内及体外筛选,获得了抗成骨分化的i MEFOR细胞（包括i MEFOR1A、i MEFOR1B、i MEFOR1C、i MEFOR1D）;（2）通过对i MEFOR细胞文库所在区域高通量测序,我们寻找到了在i MEFOR细胞中富集程度较高的单个N19片段DON1-7;对DON1-7进行体内、体外抗BMP诱导成骨分化能力鉴定,发现DON3、DON6具有较强的抗成骨分化能力;（3）对i MEFOR细胞进行全外显子测序,发现i MEFOR细胞存在4277个共同富集的SNV;随机挑选7个在筛选过程中呈趋势性富集的SNV进行mi RNA结合位点预测及验证,发现7个SNV均是mi RNA的潜在结合位点;SNV单个碱基的改变,影响mi RNA种子区域的结合;SNV对应转录本以及其潜在结合mi RNA在i MEFOR细胞中表达失调;（4）以si RNA表达为例,借助Bst XI限制性内切酶可特异识别CCANNNNN^NTGG位点特性,我们构建了以p SEB361-si RNA为载体的小RNA表达质粒,该质粒可同时双向表达多个小调控RNA或单个小调控RNA的多拷贝表达;（5）借助大小选择性磁珠（SSMBs）可快速分离分子大小差距较大的DNA/RNA的特性,我们设计并验证了质粒的快速纯化方法,极大地去除了质粒中污染的RNA,并保留质粒的超螺旋完整性,从而提高了质粒在细胞中的转染效率;（6）同理,以mi RNA为例,借助SSMBs,我们设计了从总RNA中去除长转录本,保留并富集小RNA的方法,并优化了小RNA的RT-q PCR检测策略（LTMT-Tq PCR）。结论:（1）本研究通过N19小调控RNA文库体外及体内筛选成骨分化能力不断减弱、增殖能力不断增强的i MEFOR细胞,即抗成骨分化细胞,该细胞具备骨肉瘤细胞样特性,提示该筛选过程在一定程度上模拟了骨肉瘤的发生过程;（2）富集的单个N19片段DON3和DON6在体内和体外均具有较强的抗成骨分化能力,提示DON3和DON6在抗成骨分化过程中起着重要作用;（3）机制上我们发现i MEFOR细胞中存在大量趋势性富集的SNV,N19小调控RNA极可能通过mi RNA调控SNV富集促进抗成骨分化,进而导致骨肉瘤的发生;（4）我们基于Bst XI优化了多个si RNA同时的表达系统,该系统可用于多个小调控RNA的双向表达或者单个小调控RNA多拷贝稳定表达;（5）基于SSMBs大小选择性分离原理,我们可快速去除质粒中的污染RNA,保持质粒的完整性,提高质粒转染效率;（6）我们设计并优化的LTMT-Tq PCR策略,可去除长转录本、保留并富集小RNA,从而提高低丰度小RNA的检出效率,适用于小RNA的表达谱筛查。