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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是一种由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的急性高度接触性传染病,临床表现主要为呕吐、水样腹泻和脱水等,对哺乳仔猪的危害最严重,致死率高。我国从1976年开始有该病的报道,并且最近几年流行的程度不断加强,给养猪业造成了严重的经济损失。本研究采用杆状病毒和大肠杆菌表达系统,构建获得PEDV重组N蛋白,制备成功4株N蛋白单克隆抗体,并利用其中一株单抗建立了抗原捕获ELISA抗体检测方法,为PEDV的诊断和血清学调查提供了重要工具。具体内容如下：1.表达PEDVN蛋白的重组杆状病毒的构建和鉴定采用RT-PCR方法扩增获得PEDVN基因,将其克隆到供体质粒pFastBac中,经菌液PCR、双酶切和测序鉴定正确后,将重组供体质粒pFastBac-N转化到含有穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态细菌中,经过两轮蓝白斑筛选和PCR鉴定后,获得重组穿梭载体Bacmid-N。采用脂质体将其转染至Sf9昆虫细胞,得到重组杆状病毒。经Western blot鉴定,重组杆状病毒可正确表王PEDVN蛋白,大小约为58KD。采用Ni-NTA亲和层析方法获得纯化重组N蛋白,为PEDV诊断和亚单位疫苗研究奠定了基础。2. PEDVN蛋白单克隆抗体的制备与鉴定采用RT-PCR扩增获得PEDVN基因并克隆至原核表达载体pET-28a,转化到宿主表达菌BL21后经IPTG诱导表达和Ni柱纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定结果显示,重组N蛋白大小约为58KD。将纯化的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合,PEDV N蛋白间接ELISA方法筛选,制备获得4株能稳定分泌N蛋白抗体的杂交瘤细胞株1C9、4C8、4F8和6A11。Western blot和间接免疫荧光试验证明其与PEDV和真核表达的N蛋白均有特异性反应,单抗亚类鉴定均属于IgG1,轻链为κ型。杂交瘤细胞培养上清ELISA抗体效价为1：1600-6400,腹水ELISA抗体效价达1：1.024 105以上；4株细胞连续培养20代,其ELISA抗体效价基本一致,为PEDV诊断和致病机制研究提供了有用工具。3. PEDV抗原捕获ELISA抗体检测方法的建立与应用本研究采用PEDV N蛋白单克隆抗体包被酶标板,纯化的PEDV作为捕获抗原,成功建立了PEDV抗原捕获ELISA抗体检测方法,其优化的反应条件为：单抗包被浓度为2μg/mL,37℃包被2h加4℃过夜;5%脱脂乳的磷酸缓冲液作为封闭液,37℃封闭3h；捕获抗原浓度为5μg/mL,37℃下作用3h;检测猪血清1：50稀释,37℃作用1h;羊抗猪IgG-HRP稀释度为1：2000,37℃作用45min；底物最佳作用时间为37℃10min。采用S/P值作为判定标准,设定阴、阳性对照,根据公式计算S/P值：如果S/P值≥0.4时为阳性,S/P值<0.3时为阴性,介于两者之间为可疑。该ELISA方法与PRRSV、PRV、PCV2、 CSFV和FMDV等阳性血清均无交叉反应性。检测方法批间和批内变异系数均小于10%。相对国产商品化PEDV抗体检测试剂盒,其敏感性、特异性和符合率分别为94.6%、91.3%和93.3%。应用本方法检测山东、浙江和江苏地区308份猪血清样品,PEDV抗体阳性率达89.29%。表明本方法具有较好的敏感性、特异性和符合率,可用于PEDV抗体检测和流行病学调查。