论文部分内容阅读
各类兽药的大量使用,虽然提高了动物性食品的产量,但是也对人类健康造成了潜在威胁。同时兽药残留问题也影响着我国动物性食品的出口贸易。免疫分析方法是目前兽药残留检测使用较多的方法。抗体作为免疫分析的核心试剂,其稳定性是影响免疫检测分析结果的关键因素。本论文利用分子生物学技术获得了氯霉素的基因工程抗体,并利用这一抗体建立了免疫检测方法,为氯霉素的检测提供了一种有效、稳定的检测技术。从分泌氯霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株10A3B6E中提取总RNA,并反转录成cDNA。以cDNA为模板,利用兼并引物进行PCR扩增,获得抗体基因的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),将其连接到pMD18-T载体后进行大规模测序。同时,利用木瓜蛋白酶对单克隆抗体进行水解获得Fab,SDS-PAGE电泳后,对Fab中的轻链和重链分别进行Orbitrap质谱分析,获得其中的氨基酸片段。将可变区测序结果与质谱鉴定结果进行比对分析,获得了氯霉素特异性抗体可变区序列,重链可变区和轻链可变区的长度分别为341 bp和324 bp。利用重叠延伸PCR将重链可变区、轻链可变区及连接片段进行连接,获得了 711 bp的单链抗体(scFv)基因片段。将该片段用内切酶SfiⅠ和NotⅠ进行酶切,并与经过相同酶切的表达载体pLIP6/GN进行连接,转化BL21(DE3)后,对scFv进行重组表达。在25℃,180rpm振荡培养条件下,利用0.1 mmol/L IPTG对表达菌株诱导10-14小时,成功获得出可溶性的抗氯霉素单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白(CAP scFv-AP)。利用Ni2+-NTA亲和层析柱对CAP scFv-AP进行分离纯化。利用纯化后的蛋白,通过对免疫分析条件的优化,建立了一种简便、快捷、实用的氯霉素直接竞争ELISA检测方法。优化后的检测条件为:包被原包被量0.1μg/孔;封闭液1%脱脂乳粉;样品稀释液0.02 mol/LTBS(pH 5.7)。在最佳条件下,该检测方法的检测灵敏度(IC50)与检测限(IC15)分别为6.92:±0.24 ng/mL和1.11±0.05ng/mL。选择3种氯霉素结构类似物和2种兽药进行特异性分析,结果显示该检测方法对氯霉素琥珀酸钠、氟甲砜霉素、甲砜霉素、四环素、链霉素的交叉反应率分别为42.34%、0.37%、0.22%、0.22%和0.12%,说明所建立的检测方法具有较好的特异性。选择对虾和鳕鱼作为实际样品,分别向其添加10、30、100 ng/g氯霉素,测得其回收率为72.53%-107.67%,变异系数小于10%,表明方法具有较好的精密度。本研究为氯霉素的大规模检测提供了一种有效的初筛技术,这对于保障动物源性食品安全具有重要的实际意义。