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目的:为进一步研究研究RMP(RPB5-mediating protein)功能制备其多克隆抗体,并通过脂质体瞬时转染方法回复稳定干扰细胞株中RMP的表达,研究RMP对人肝癌细胞SMMC-7721生物学特性的影响。方法:1. RMP多克隆抗体的制备。2. Western blot检测所制备的多克隆抗体特异性。3.采用脂质体瞬时转染法分别将真核表达质粒pFLAG-CMV-4-RMP及空载体pFLAG-CMV-4转入稳定干扰RMP的肝癌细胞株。利用RT-PCR和Western blot检测目的基因在各细胞株中RNA及蛋白的表达。4. MTT法检测各细胞株的增殖变化。5. MTT法检测各细胞株的黏附能力。6.体外划痕实验检测细胞迁移能力。7. Transwell检测各细胞株的侵袭能力。8.经60Coγ射线辐照后,流式细胞术检测相应时间点各细胞株周期及凋亡的变化。9. RT-PCR法检测与细胞周期和凋亡相关基因的表达。结果:1.通过SDS-PAGE法确定含有RMP蛋白短突变体GST-D1相比GST-D3、GST-D5、GST-D9和GST-D10表达量最高,所制备的多克隆抗体具有最高的抗原抗体反应性,纯化融合蛋白后免疫新西兰大白兔获得抗血清,Western Blot显示抗体具有一定的特异性。2.脂质体介导的过表达质粒瞬时转染干扰细胞株,经RT-PCR及Western blot确认了RMP在稳定干扰细胞株中回复表达。3.通过MTT法绘制细胞生长曲线,结果显示RMP可以促进SMMC-7721细胞生长,同时降低细胞的粘附能力。4.划痕实验结果显示RMP可促使细胞的迁移能力增加。5. Transwell结果显示RMP促进细胞侵袭能力增加。6.经60Coγ射线诱导后,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,随着时间点推移,与对照组相比G2期阻滞逐渐降低,细胞凋亡减少。7. RT-PCR方法检测显示促凋亡基因Bax和Caspase3表达下调,凋亡抑制基因Bcl-2表达上调。结论:本研究在原核表达系统中成功表达和纯化了GST融合蛋白,制备了RMP多克隆抗体并成功用于Western Blot。RMP能够促进肝癌细胞SMMC-7721的生长,降低细胞的黏附能力、促进细胞的迁移并提高细胞的侵袭能力。通过调节细胞周期相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达,阻止细胞凋亡,使损伤细胞有机会得到修复而不是走向凋亡。提示RMP在肝癌的基因治疗和干预方面可能是一个潜在的作用靶点。