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目的:胆管癌是一种发源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤。临床上根据病理结构的位置,将其分为肝外胆管癌(Extrahepatic cholangiocarcinoma,ECCA)和肝内胆管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICCA)两种类型。近年来肝内胆管癌发病率逐年上升,由于该病起病隐匿早期难以被诊断,且临床上治疗药物匮乏,造成预后较差,死亡率较高。因此,寻找肝内胆管癌新靶标和潜在的治疗药物具有重要意义。本课题组旨在通过对天然产物化合物的筛选,找到能治疗肝内胆管癌的候选药物。利用RNA-seq和生物信息学分析方法揭示候选药物对治疗肝内胆管癌细胞可能存在的新机制,并寻找潜在作用靶点,设计实验探讨候选药物盐酸石蒜碱对肝内胆管癌细胞RBE的影响机制,为研究盐酸石蒜碱对肝内胆管癌的治疗应用提供理论基础。方法:1.靶向RBE细胞的天然产物化合物的筛选本实验采用CCK-8细胞活性检测实验筛选天然产物化合物(640个)对肝内胆管癌细胞RBE的抑制作用。首先,选用30μM浓度的天然产物化合物处理肝内胆管癌细胞RBE,得到抑制率大于50%的候选天然产物化合物;接着,选用10 μ M浓度的候选天然产物化合物处理RBE细胞,得到抑制率大于50%的天然产物化合物;最后,选用5 μ M浓度的天然产物化合物处理RBE细胞,得到抑制率大于50%的天然产物化合物。结合文献,挑选出天然产物化合物:盐酸石蒜碱继续深入研究其对肝内胆管癌细胞RBE的影响。2.探索盐酸石蒜碱对肝内胆管癌细胞RBE的作用通过CCK-8和集落克隆形成实验检测细胞增殖,流式细胞实验和免疫荧光实验检测细胞周期和凋亡,划痕实验、Transwell细胞迁移和侵袭实验检测细胞的迁移和侵袭性,探索盐酸石蒜碱对肝内胆管癌细胞RBE潜在的作用机制。3.RNA-seq揭示盐酸石蒜碱抑制肝内胆管癌细胞RBE的作用靶点我们用5 μM的盐酸石蒜碱作用处于对数生长期的肝内胆管癌细胞RBE 12hours,然后加入适量的TRIzol收集并提取总RNE样品送检进行转录组测序。Western Blot实验进一步检测胆固醇代谢信号通路中相关作用靶点SQLE、FDFT1、HMGCSI、DHCR24、DHCR7、MVK、IDI2、IDI1 的表达,揭示 SQLE 和 FDFT1 是盐酸石蒜碱抑制肝内胆管癌细胞RBE生长的作用靶点。4、探究SQLE、FDFT1在肝内胆管癌细胞RBE的作用构建 zip-control、zip-shRNA SQLE 和 zip-shRNA FDFT1 质粒,转染 293T 细胞,将获得的病毒液转染RBE细胞,经过抗生素筛选,Western Blot实验确保沉默SQLE或 FDFT1,得到 zip-shRNA SQLE RBE、zip-shRNA FDFT1 RBE 和 zip-Control RBE细胞。通过CCK-8细胞活性检测实验、克隆形成实验,研究敲低SQLE和FDFT1对肝内胆管癌细胞RBE的影响,验证盐酸石蒜碱靶向治疗肝内胆管癌是通过降低SQLE和FDFT1的表达进而抑制肝内胆管癌细胞RBE的生长。5、研究盐酸石蒜碱联合吉西他滨对肝内胆管癌细胞RBE的影响CCK-8细胞活性检测实验探究盐酸石蒜碱联合吉西他滨对肝内胆管癌细胞RBE的抑制作用的影响,用Western Blot方法检测SQLE、FDFT1、HMGCS1、DHCR24、DHCR7、MVK、IDI2、IDI1的表达并探讨盐酸石蒜碱联合吉西他滨对肝内胆管癌细胞RBE的作用。结果:1、由天然产物化合物筛选实验的结果可知,盐酸石蒜碱具有明显抑制肝内胆管癌RBE生长的作用,其IC50为5 μ M。我们选择盐酸石蒜碱作为候选药物,继续深入探讨盐酸石蒜碱对肝内胆管癌细胞RBE的作用机制,期待找到新的作用靶点以利于改变肝内胆管癌的诊疗现状。2、根据CCK-8细胞活性检测实验、克隆形成实验验证盐酸石蒜碱抑制肝内胆管癌细胞RBE的生长;流式细胞技术检测盐酸石蒜碱对肝内胆管癌细胞RBE的细胞周期与凋亡有影响,即盐酸石蒜碱诱导肝内胆管癌细胞RBE发生G2/M期阻滞,诱导肝内胆管癌细胞RBE凋亡;免疫荧光实验证明盐酸石蒜碱促进肝内胆管癌RBE的凋亡;Transwell细胞迁移、侵袭实验和划痕实验论证盐酸石蒜碱对肝内胆管癌细胞RBE的细胞迁移和侵袭性有抑制作用。以上实验结果表明盐酸石蒜碱可抑制肝内胆管癌细胞的生长。3、通过盐酸石蒜碱作用于肝内胆管癌细胞RBE提取总RNA进行转录组测序;RNA-seq揭示盐酸石蒜碱对肝内胆管癌细胞RBE的作用通路与胆固醇代谢相关,IPA分析新靶点SQLE、FDFT1;为进一步探讨新靶点SQLE、FDFT1在抑制肝内胆管癌细胞RBE生长的作用,采用Western Blot实验验证盐酸石蒜碱抑制肝内胆管癌细胞RBE中SQLE、FDFT1的表达;实验结果表明肝内胆管癌细胞RBE表达SQLE、FDFT1下降时其生长受到抑制,即盐酸石蒜碱通过SQLE、FDFT1抑制肝内胆管癌细胞RBE的生长。4、CCK-8细胞活性实验验证盐酸石蒜碱增强吉西他滨对肝内胆管癌细胞的敏感性;Western Blot实验验证盐酸石蒜碱通过降低SQLE和FDFT1的表达进而增强吉西他滨对肝内胆管癌细胞RBE的敏感性。结论:1、筛选出天然产物化合物盐酸石蒜碱抑制肝内胆管癌细胞RBE的增殖;2、天然产物化合物盐酸石蒜碱抑制肝内胆管癌细胞RBE的SQLE和FDFT1表达;3、天然产物化合物盐酸石蒜碱通过降低SQLE和FDFT1的表达抑制肝内胆管癌细胞RBE的生长。