【摘 要】
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加州鲈（Micropterus salmoides）肉质嫩,生长快,适应广,是我国重要的养殖品种之一。而病害成为制约其产业发展的因素之一。镰刀菌（Fusarium）分布广泛,能侵染各种植物、人类和水产动物等。鱼类在体表损伤或处于不良养殖环境时,容易感染镰刀菌,发病迅速,致死率较高,造成重大的经济损失,目前尚无有效的防治方法。因此,有必要开展镰刀菌病的研究。2019年7月,某循环水室饲养的加州鲈头部
【基金项目】
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广东财政专项补助资金； 广东省省级现代农业产业技术体系项目； 广州市科技项目；
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加州鲈（Micropterus salmoides）肉质嫩,生长快,适应广,是我国重要的养殖品种之一。而病害成为制约其产业发展的因素之一。镰刀菌（Fusarium）分布广泛,能侵染各种植物、人类和水产动物等。鱼类在体表损伤或处于不良养殖环境时,容易感染镰刀菌,发病迅速,致死率较高,造成重大的经济损失,目前尚无有效的防治方法。因此,有必要开展镰刀菌病的研究。2019年7月,某循环水室饲养的加州鲈头部、胸鳍、背鳍、尾鳍出现充血发炎,随后逐渐溃烂,并附有白色丝状物,出现死亡现象。鉴此,本论文从加州鲈患病部位分离纯化到一株致病性腐皮镰刀菌,研究了其生物学特性和防治方法,同时对加州鲈感染镰刀菌前后的脾脏组织进行转录组测序,主要研究结果如下:1.从加州鲈患病处分离得到一株优势菌MY1,人工感染确定是致病菌,半数致死量(LD50)为1.03×104个/m L。通过形态特征和r DNA-ITS序列分析,鉴定MY1为腐皮镰刀菌（F.solani）。2.腐皮镰刀菌在10℃～35℃和p H=4.32～11.44时可生长,最适温度为25℃～30℃,最适p H 7.85。Na Cl≥10%时,不生长。最适生长培养基为PDA;最适碳源为乳糖;最适氮源为硝酸钠。光照对生长无显著影响。在10℃～35℃、p H=4.32～11.44时可产孢,最适温度25℃,最适p H 7.85。Na Cl≥8%时,不产孢。产孢最适培养基为PDA;最适碳源为淀粉和D-果糖;最适氮源为蛋白胨。光照利于产孢。3.腐皮镰刀菌菌丝对益康唑、大蒜和甲霜灵敏感,MIC值分别为4μg/m L、0.1 g/m L、25 mg/L;孢子对两性霉素B、克霉唑、益康唑、制霉菌素和甲霜灵敏感,MIC分别为8、16、8、32 ug/m L和50 mg/L。4.从加州鲈体表和养殖水中共分离到42株细菌,以腐皮镰刀菌MY1为指示菌,筛选出1株拮抗菌JK10。结合形态、生化特征和16S r RNA序列分析,确定JK10为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。对氨曲南等9种抗生素耐药。JK10具安全性,且拮抗活性可稳定遗传给下一代。5.通过单因素试验和正交试验,确定菌JK10的最佳发酵条件:温度30℃,p H值8,转速180 r/min,接种量0.5%,装液量50 m L;最佳培养基组分为14 g/L乳糖,7 g/L酵母粉,10 g/L氯化钾。与优化前相比,对数末期提前2 h,OD600nm值为之前的1.15倍,抑菌率提高了9.5%。6.枯草芽孢杆菌JK10产蛋白酶、淀粉酶和挥发性物质,对腐皮镰刀菌的生长有一定的抑制作用。抑菌物质主要存在于沉淀物中,对热、酸碱和紫外线有较好的耐受性,适宜常温储存。7.对加州鲈感染镰刀菌前后的脾脏组织进行转录组分析,获得43.72 Gb clean reads,检测到表达的unigene 89458条,差异表达基因2195个,其中上调1519个,下调676个。GO条目分析,差异基因主要涉及小分子代谢、免疫过程、酮酸代谢过程等。差异基因KEGG通路富集到类风湿性关节炎、NF-k B信号通路、细胞因子受体相互作用等。另外,对随机筛选7个免疫基因进行q RT-PCR验证,表达趋势与RNA-seq一致,证实了转录组数据的可靠性。不仅丰富了加州鲈数据库,也为研究镰刀菌致病和免疫机制提供参考信息。本文研究了病原菌的生物学特性和防治方法,同时对感染腐皮镰刀菌前后的脾脏组织进行了转录组分析,为病害的防治提供了依据,也为加州鲈抗真菌感染的免疫机制研究奠定了基础。
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