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新城疫病毒(Newcastle Disease virus，NDV)是副黏病毒科禽腮腺炎病毒属(AvuLavirus)的禽副黏病毒Ⅰ型(APMV-1)。NDV基因编码六种主要结构蛋白组成并且研究较多的P基因可以通过RNA编码产生两个非结构蛋白V蛋白和W蛋白。维甲酸诱导基因-Ⅰ(retinoic acid induced gene-Ⅰ，RG-Ⅰ)是识别病毒RNA激发Ⅰ型IFN产生的重要传感器，线粒体抗病毒信号蛋白MAVS(Mitochondrial antiviral signalingprotein，IPS-1/VISA/Cardif也是它的名称)蛋白是RIG-Ⅰ样受体在先天性抗病毒免疫中的接头蛋白，新城疫病毒感染时可诱导宿主细胞产生免疫性干扰素(IFN)来抑制病毒增殖，文献记载新城疫病毒编码的V蛋白等多种蛋白阻止IFN的抗病毒功能，因此病毒V蛋白与细胞MAVS蛋白是否存在相互作用近年来成为新的研究热点。NDV的V蛋白结构同同类的其他副黏病毒的V蛋白具有相似的特殊结构，发现副黏病毒通过RNA编码，产生V蛋白具有阻断IFN抗病毒活性的功能。 已有研究发现NDVV蛋白对MAVS信号通路有降解作用，本实验通过外源转染副黏病毒V蛋白，检测其对细胞MAVS蛋白表达及IFN-β生成量的影响，结果说明副黏病毒V蛋白通过泛素-蛋白酶体途径降解MAVS蛋白，并且病毒是通过MAVS蛋白水平干扰IFN的产生。实验还通过获得MAVS不同片段的克隆来研究病毒V蛋白与MAVS的相互作用，发现副黏病毒V蛋白与MAVS作用的特异性。总之，实验研究验证病毒V蛋白的在拮抗干扰素中的重要作用。 一、NDV诱导MAVS降解，但下游IFN信号通路仍然激活 本研究使用了NDV、SeV感染HeLa6、9、12、24h后检测MAVS表达水平，发现在病毒感染24h降解MAVS。本实验还证明了NDV以一种剂量依赖效应诱导MAVS降解，并且NDV还可以降解外源转染的MAVS。 为了验证细胞感染NDV后MAVS下游信号通路的激活情况，本实验在HeLa细胞感染NDV3、6、9、12h后Western-Blot检测TBK l/p-TBK l/pcbp2/Mavs/p-IRF-3蛋白表达量，检测结果显示NDV感染前期不引起p-TBK1、p-IRF-3的激活，而在感染后期激活明显。结果表明，影响干扰素产生的TBK1、IRF-3等的激活可能是由其他信号通路激活引起的，后续实验有待进一步研究。 二、NDV V蛋白降解MAVS 研究发现构建NDV的Flag-V基因能够降解细胞的MAVS蛋白，为进一步的验证是否是NDV的V蛋白在细胞先天性免疫中发挥MAVS降解的作用，实验通过已构建的Flag-V蛋白转染HeLa细胞和A549细胞，检测MAVS表达水平。为了证明RIG-MDA5信号通路是否被NDV的V蛋白干扰，通过荧光素酶实验从干扰素启动子水平检测转染不同浓度梯度的Flag-V和Flag-MAVS后对细胞IFN-β产生的影响，结果显示随着转染Flag-V浓度的升高，在转染Flag-MAVS时IFN-β产生水平逐渐降低，而转染TLR3下游的接头蛋白Trif则没有影响。 三、副黏病毒V蛋白降解MAVS 研究中我们构建副黏病毒的SeV、MEV验证随着转染V浓度的升高，外源转染MAVS及NDV感染诱导的IFN-β水平是降低。为了进一步论证NDVV蛋白能否降解MAVS，本实验通过实验室已有的ZJ1病毒V蛋白突变株以及WT感染HeLa细胞后观察MAVS降解情况，结果证明病毒V蛋白缺失后细胞MAVS蛋白未出现降解情况，也确证了NDVV蛋白对MAVS的作用。 四、NDV通过泛素-蛋白酶体途径降解MAVS 通过293T细胞转染HA-K48，24h后感染NDV后做CO-IP实验，不感染作对照，观察是否MAVS为泛素化降解，结果显示转染HA-K48后感染NDV的蛋白互作实验说明是NDV通过蛋白酶体泛素化降解MAVS。MAVS蛋白降解通过两条通路，一条是蛋白酶体途径，另一条是通过自噬通路。为了验证这两个通路对NDV感染后对MAVS降解的影响，本实验通过用MG132、CQ、E64d/PepstatinA、wortmannin不同浓度处理检测MAVS降解是否延迟，结果显示自噬阻断药物处理HeLa细胞后并不影响MAVS的降解，而蛋白酶体抑制剂MG132则抑制了MAVS的降解，说明其主要是通过泛素-蛋白酶体途径降解。 五、NDVV蛋白与MAVS的特异性反应 有研究已证明PCBP2可以与MAVS180-540这一片段相互作用，由于本实验已排除PCBP2降解MAVS的作用，为了论证病毒V蛋白与MAVS分段之间作用的特异性，本实验在293细胞共转染NDVV蛋白与MAVS分段，然后Western-Blot检测相互作用的特异性反应。结果显示NDV V蛋白与细胞MAVS蛋白的360-540片段发生特异性反应。