目的:　　IgA肾病(Primary Immunoglobin A nephreopthy，IgAN)是指肾小球系膜区以IgA或IgA沉积为主，可伴系膜细胞增生和系膜基质扩张的肾小球疾病。IgAN是肾小球性血尿最常见的原因，是世界范围内一种常见的肾小球疾病。在不同地区IgAN的发病率不同，以亚洲及澳洲发病率为高。大约25％的患者在确诊IgAN后5年～25年内发展为终末期肾脏疾病(end stage renal disease，ESRD)。迄今为止IgAN的发病机制尚不明了，亦无特效的药物治疗方法，因此深入探讨IgAN的发生机制，寻找新的治疗措施，控制和延缓疾病的进展，是当前研究的重点。　　IgAN是一种多致病因素引起的疾病，近年来有学者认为IgAN发病机制与骨髓干细胞(Bone Marrow Stem Cell，BMC)有关，并提出IgAN可能是一种干细胞疾病的观点。国外有研究应用骨髓干细胞移植治疗IgAN大鼠，发现移植后肾小球系膜区IgA的沉积明显减少。内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)是骨髓干细胞的成分之一，是成年个体中与血管新生关系最为紧密的干细胞成分。近年的研究发现内皮祖细胞参与血管损伤修复及出生后的治疗性血管新生，在动脉粥样硬化，脑梗塞，下肢缺血等缺血性疾病的治疗上成为研究热点。本研究建立IgAN大鼠模型，观察IgAN大鼠骨髓内皮祖细胞的变化，并行内皮祖细胞移植治疗，旨在研究内皮祖细胞移植对IgAN治疗作用并探讨治疗机制。　　本研究分以下三部分进行:1.IgA肾病动物模型骨髓内皮祖细胞数量及功能变化。2.内皮祖细胞移植对IgA肾病大鼠的治疗作用。3.内皮祖细胞移植治疗IgA肾病的可能机制。　　材料和方法:　　第一部分:1.动物分组及模型鉴定:雌性SD大鼠16只，随机分为正常对照组和IgAN组，每组8只。①IgAN组:清洁级雌性SD大鼠，隔天灌服牛血清白蛋白(BSA)400mg/kg，持续6周;于第6.8周分别予脂多糖(LPS)0.25mg/kg，尾静脉注射。皮下注射蓖麻油0.5ml+四氯化碳(CCL4)0.1ml，每周一次，持续9周。②正常对照组:分别给予等量生理盐水行灌胃，尾静脉注射及皮下注射。两组大鼠均正常饮食，饮水。在造模结束后，留取尿标本。处死大鼠留取血标本、肾组织标本、检测24h尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐、血IgA水平，HE染色观察肾组织病理改变，免疫荧光法观察肾组织IgA的沉积。2.EPC的分离，鉴定及培养:于超净台中取出大鼠股骨和胫骨，密度梯度法获得骨髓单核细胞悬液，接种于添加细胞因子的M199培养基中诱导培养。通过倒置显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测EPC表面抗原CD34、CD133、FLK-1的表达以及共聚焦显微镜观察FITC-UEA-1和DIL-ac-LDL双染色来进行鉴定。3.EPC功能比较:CCK8检测内皮祖细胞的增殖能力，Transwell小室检测内皮祖细胞的迁移能力。比较组间差异。　　第二部分:1.模型制备方法及鉴定:SD大鼠，隔天灌服牛血清白蛋白(BSA)400mg/kg，持续6周;于第6.8周分别予脂多糖(LPS)0.25mg/kg，尾静脉注射。皮下注射蓖麻油0.5ml+四氯化碳(CCL4)0.1ml，每周一次，持续9周。检测24h尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐、血IgA水平，HE染色观察肾组织病理改变，免疫荧光法观察肾组织IgA的沉积。2.EPC的分离及培养:于超净台中取出大鼠股骨和胫骨，密度梯度法获得骨髓单核细胞悬液，接种于添加细胞因子的M199培养基诱导培养。3.动物分组及处理:雌性SD大鼠48只，在IgAN造模结束后随机分2组。①IgA肾病大鼠EPC移植组（简称EPC组，n=30）:经尾静脉给予同种雌性SD大鼠骨髓源性内皮祖细胞（骨髓内皮祖细胞数量3×106/只，0.5ml/只）。②IgA肾病大鼠未移植组（简称IgAN组，n=6）:经尾静脉给予等量生理盐水（0.5ml/只）。另设正常对照组(n=12):其中6只经尾静脉给予等量生理盐水(0.5ml/只);另外6只经尾静脉给予同种雌性SD大鼠骨髓源性内皮祖细胞（骨髓内皮祖细胞数量3×106/只，0.5ml/只）仅用于观察EPC的归巢。EPC组在移植前和移植后的1、3、7、14天分别处死6只大鼠，IgAN组和正常对照组在移植后的14天处死大鼠。大鼠处死前用代谢笼留取24h尿标本。处死时留取血标本、肾组织标本。检测24h尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐。HE和PAS染色观察肾组织病理改变，应用PAS染色切片计算肾小球系膜基质增生程度，免疫组化法检测肾组织CD31的表达，利用CD31染色的阳性物质积分光密度值代表肾小管周围毛细血管网密度。免疫荧光法观察内皮祖细胞在肾脏的归巢（移植前用红色荧光染料PKH26标记内皮祖细胞），　　第三部分:1.模型制备方法及鉴定:隔天灌服牛血清白蛋白(BSA)400mg/kg，持续6周;于第6.8周分别予脂多糖(LPS)0.25mg/kg，尾静脉注射。皮下注射蓖麻油0.5ml+四氯化碳(CCL4)0.1ml，每周一次，持续9周。检测24h尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐、血IgA水平，HE染色观察肾组织病理改变，免疫荧光法观察肾组织IgA的沉积。2.EPC的分离及培养:于超净台中取出大鼠股骨和胫骨，密度梯度法获得骨髓单核细胞悬液，接种于添加细胞因子的培养基诱导培养。3.动物分组及处理:雌性SD大鼠42只，在IgAN造模后结束随机分2组。①IgA肾病大鼠EPC移植组(简称EPC组，n=30)，经尾静脉给予同种雌性SD大鼠骨髓源性内皮祖细胞（骨髓内皮祖细胞数量3×106/只，0.5ml/只）。②IgA肾病大鼠未移植组（简称IgAN组，n=6），经尾静脉给予等量生理盐水（0.5ml/只）。另设正常对照组(n=6)，经尾静脉给予等量生理盐水（0.5ml/只）。EPC组在移植前和移植后的1、3、7、14天分别处死6只大鼠，IgAN组和正常对照组在移植后的14天处死大鼠。大鼠处死时留取肾组织标本。应用免疫组织化学，Western-blotting及实时定量PCR的方法比较各组之间以及EPC组移植前后肾组织HIF-1a，MCP-1，CD105的表达变化。　　数据处理:用计算机统计软件SPSS17.0进行分析处理。计量数据用均数±标准差（(x)±s）表示，两组间均数比较采用t检验，组间差异比较采用单因素方差分析，当P＜0.05时，差异有统计学意义。　　结果:　　第一部分:1.生化指标比较: IgAN组24小时尿蛋白排泄量明显增加，是正常对照组的7.1倍，与正常对照组比较差异有统计学意义，(P＜0.01)。IgAN组BUN，Scr增高，与正常对照组比较差异有统计学意义，(P＜0.01)。正常对照组血清IgA（26.04±1.12）μg/ml，IgAN组血清IgA水平增高，为(28.99±1.30)μg/ml，与对照组比较差异有统计学意义，(P＜0.01)。2.流式细胞仪检测结果:IgAN组骨髓CD133+FLK+，CD34+表达细胞较正常对照组明显减少，差异有统计学意义，(P＜0.01)。3.细胞计数:激光共聚焦显微镜下，对正在分化的EPC计数，IgAN组骨髓内皮祖细胞数较正常对照组减少33.3％，差异有统计学意义，(P＜0.05)。4.EPC增殖能力:48h后两组细胞增殖出现显著差异，分别在48h，72h比较两组的A450吸光值，IgAN组骨髓EPC增殖能力显著下降，差异均有统计学意义，(P＜0.01)。5.EPC的迁移能力:IgAN组骨髓EPC的迁移能力较正常组下降约10％，差异有统计学意义，(P＜0.05)。　　第二部分:1.生化指标比较:与IgAN组比较，EPC组尿蛋白排泄量明显减少，BUN、Scr明显下降，差异均有统计学意义，(P＜0.05)。EPC组在移植后7天，14天尿蛋白排泄量、BUN、Scr，与移植前比较明显减少。差异均有统计学意义，(P＜0.05)。2.肾脏形态学:HE染色，IgAN组肾组织可见肾小球系膜细胞增多，系膜基质增宽，部分肾小管上皮细胞浊肿变性，小管形态不规整。EPC组系膜基质及肾小管病理改变较IgAN组减轻。PAS染色，肾小球ECM沉积EPC组（5.59±1.94％）较IgAN组（11.06±1.4％）明显减少，差异有统计学意义，(P＜0.01)。3.免疫组织化学结果:IgAN组肾组织CD31阳性表达较正常对照组减少，(P＜0.01)。EPC组肾组织CD31阳性表达逐渐增加，PTC密度增加，与IgAN组比较差异有统计学意义，(P＜0.01)。4.EPC的归巢:PKH26阳性表达呈红色荧光，在移植后1天即可见PKH26阳性细胞出现在IgAN大鼠的肾脏，主要分布于肾间质。在移植后的3，7，14天可见肾间质和肾小球PKH26阳性细胞逐渐增多。　　第三部分:1.免疫组织化学结果:①EPC组肾组织MCP-1、HIF-1a的表达较IgAN组明显减少，存在显著差异。EPC组在移植后1，3，7，14天大鼠肾组织MCP-1、HIF-1a的表达较移植前逐渐减少。②正常组大鼠，CD105在肾小球和肾间质微弱表达。在移植前和IgAN组大鼠肾间质表达明显增多。EPC组在移植后第3天CD105表达明显减少，7、14天表达逐渐增多。2.免疫印迹结果:①EPC组大鼠肾组织MCP-1、HIF-1a的表达逐渐减少，较IgAN组明显减少。差异有统计学意义。②IgAN组CD105表达水平较正常组增高，EPC组在移植后1天CD105水平有所下降，3天肾组织CD105蛋白表达明显减少，7天，14天CD105蛋白表达逐渐增加。　　3.实时荧光定量PCR结果:①EPC组在移植后1，3，7，14天肾组织MCP-1表达逐渐减少。分别较移植前减少32.38％，45.71％，53.8％，68.1％，差异有统计学意义。②正常组大鼠肾皮质CD105mRNA少量表达，IgAN组CD105mRNA表达增多，EPC组在移植后第三天CD105mRNA显著减少，7，14天逐渐增多。③正常组大鼠肾组织HIF-1amRNA少量表达，IgAN组HIF-1amRNA表达明显增加，达正常组的2.43倍，移植后HIF-1a mRNA表达逐渐减少。　　结论:　　本研究结果表明:　　1.IgAN动物模型骨髓EPC数量减少，EPC增殖能力减低，迁移能力下降（与正常对照组比较）。说明IgAN大鼠骨髓EPC数量和功能受损，可能影响内皮细胞的损伤修复和有效的更新。　　2.EPC移植治疗，可以使IgAN大鼠尿蛋白的排泄减少，肾功能得到改善。　　3.EPC移植治疗，IgAN大鼠肾组织肾小球ECM沉积减少，肾小管周围毛细血管密度增加。可能进而延缓肾小球硬化和肾间质纤维化的进展，为IgAN的治疗开拓了新途径。　　4.EPC移植治疗，IgAN大鼠肾组织MCP-1，HIF-1a的表达逐渐减少，CD105的表达在移植3天后逐渐上调。推测EPC移植治疗IgAN的可能机制是减轻肾小管间质炎症反应，促进血管新生，改善肾间质缺血、缺氧，进而延缓疾病进展。