生物分子的准确可靠诊断对疾病早期治疗和阐明各种生理和病理过程至关重要。基于分子信息层面的检测和认知而建立起的个性化医学使治疗许多罕见疾病成为现实。经过几十年的发展,已有多种生物分子检测平台相继被提出,但对复杂样本中低丰度生物分子检测及全球性大爆发疾病的快速诊断仍具有挑战性。此外,依赖于大型检测设备的传统分子诊断技术操作复杂,检测成本高,涉及复杂的样本预处理,需要专业人员操作,难以实现大规模部署和现场快速检测。自CRISPR/Cas技术出现以来,便在生物分子检测领域得到了突破性的应用,并被认为是下一代分子诊断技术。高灵敏度和特异性是生物传感器构建过程中最关键的两个因素,CRISPR/Cas具有序列依赖性识别特点,确保靶标检测的特异性。此外,CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13在识别靶标核酸之后,引发的反式切割对外源信号进行探针源源不断的剪切,使CRISPR/Cas成为一种信号放大和读出系统,从而确保了检测灵敏度。CRISPR/Cas和生物放大技术结合将进一步提高检测灵敏度,实现高度灵敏、特异、快速、经济高效地对靶标核酸进行多重检测,无需专业操作人员和复杂设备,适用于现场部署和即时检测。因此,本文基于CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13的高特异性和自放大特性,结合生物放大技术,构建了五种CRISPR/Cas生物传感器,用于单链核苷酸、DNA甲基化、碱性磷酸酶、金黄色葡萄球菌和ATP的超灵敏诊断和检测。具体工作如下:（1）构建了一种由CRISPR/Cas9介导的G4-EXPAR策略（Cas-G4EX）,用于ssRNA和ssDNA的位点特异性检测。通过引入短链DNA PAMmer序列,使CRISPR/Cas9能够对目标ssRNA或ssDNA进行位点特异性切割,释放出具有3’端特定序列的产物片段,并用作引物启动后续的序列依赖性指数扩增反应（EXPAR）。再将血晶素（hemin）、钾离子和EXPAR扩增产物一起组装成G-四链体（G4/hemin）,G4/hemin催化ABTS-H2O2体系反应,并伴随绿色催化产物ABTS·+的生成,实现可视化检测ssRNA和ssDNA靶标。所构建的Cas-G4EX具有优异的位点特异性识别能力和高性能扩增效率,对ssRNA和ssDNA人工合成序列的最低检测限分别为250 aM和100 aM,并对单链核酸的单碱基突变展示出优异的识别能力。此外,CRISPR/Cas9系统的可编程性使Cas-G4EX成为对任意序列的ssRNA或ssDNA的通用检测新方法。（2）基于甲基化敏感的双重酶切系统和RPA介导的CRISPR/Cas13a构建出用于DNA甲基化超灵敏检测的新方法（DESCS）。甲基化敏感的双重酶切系统能够有选择性地消解非甲基化DNA,但对甲基化DNA靶标无响应。结构完整的甲基化DNA靶标启动RPA扩增,携带T7启动子的RPA扩增产物执行T7转录,生成大量的ssRNA。ssRNA激活CRISPR/Cas13a的ssRNase活性,并对外源RNA FQ-信号探针（修饰5’-FAM和3’-BHQ1的短序列ssRNA）进行反式切割,获取荧光检测信号。所构建的DESCS对人类SEPT9基因中CpG岛甲基化检测具有优异的灵敏度,线性范围分别为200 aM～10 fM和10 fM～20 pM,检测限为86.4 aM,可有效地识别0.01%的低丰度甲基化水平。此外,DESCS被进一步集成于侧向流生物传感器（LFB）,实现对DNA甲基化的POCT可视化分析。（3）基于靶标诱导的转录扩增来触发Cas13a的反式切割活性,构建出用于超灵敏测定碱性磷酸酶（ALP）活性的新方法（TITAC-Cas）。简单而稳定的5’P-T7启动子/模板双链体DNA用作ALP底物,ALP去磷酸化避免T7启动子被λexo消解。结构完整的5’OH-T7启动子/模板双链体执行T7转录,产生大量的单链ssRNA,且产物ssRNA与crRNA的间隔区域完全互补。随后,CRISPR/Cas13a的ssRNase活性被ssRNA产物激活,并表现出对外源RNA FQ-信号探针的非特异性切割,释放荧光信号。所构建的TITAC-Cas涉及三重信号放大,包括ALP催化磷酸基团水解的自放大、T7转录扩增和CRISPR/Cas13a反式切割扩增。可在宽线性范围内(0.008～250 U·L-1)实现对ALP活性的超灵敏测定,检测限为0.006 U·L-1。此外,TITAC-Cas成功用于测定HepG2细胞裂解物中的ALP活性,并具有筛选ALP酶抑制剂的能力,为诊断ALP相关疾病提供了新方法。（4）使用CRISPR/Cas12a系统对MRSA的鉴定及其可视化检测应用。通过聚合酶链反应（PCR）扩增金黄色葡萄球菌种属特异性基因（spec基因）和耐甲氧西林基因（mecA基因）,根据spec基因和mecA基因的序列,设计并合成了对应的可编程crRNA。PCR产物与对应的crRNA间隔序列互补,并被CRISPR/Cas12a识别,解锁Cas12a的反式切割活性,非特异性消解外源DNA FQ-信号探针,获取荧光检测信号。进一步设计并合成了AuNPs-DNA探针,用于金黄色葡萄球菌的可视化鉴定。细菌基因组PCR扩增产物解锁Cas12a的ssDNase活性,对连接探针（DNA linker）反式切割,导致AuNPs-DNA探针呈现无聚集的超分散态,产生明显的红色可视化信号。基于CRISPR/Cas12a构建的检测平台可实现对MRSA的高选择性和超灵敏检测（检测限约33 cfu/mL）,并对临床复杂样本中的MRSA进行了精准鉴定,为病原微生物诊断提供了一种具有普遍性和兼容性的通用平台。（5）将变构探针介导的链置换扩增（SDA）和CRISPR/Cas12a整合在一起,构建出用于ATP超灵敏检测的四阶信号放大体系（ASD-Cas）。设计具有平齐末端发夹结构的变构探针（AH）,减少SDA反应期间自延伸和非特异性扩增引起的背景信号干扰。ATP与AH探针的5’端的适配体区段结合,随后打开AH探针发卡结构,在辅助引物的作用下启动SDA反应。扩增产物ssDNA被CRISPR/Cas12a系统识别,并解锁Cas12a的ssDNase活性,导致对外源DNA FQ-信号探针的强烈反式切割。通过四级信号放大,ASD-Cas对ATP检测具有高灵敏度和低背景干扰。最佳条件下,ASD-Cas对ATP检测线性范围为2 pM至10μM,检测限（LOD）低至1.8 pM。ASD-Cas成功用于5%正常人血清样品中ATP的检测,研究结果显示,ASD-Cas在小分子检测方面有潜在的应用价值。