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鱼类是常见的过敏食物,我国作为鱼类生产及消费大国,由鱼类引起的食物过敏问题不容忽视。小清蛋白(Parvalbumin,PV)是鱼类主要过敏原。随着对鱼类过敏原性质研究的深入,通过加工处理消减鱼类过敏原的致敏性,开发低致敏性鱼类制品将具有重要的意义。美拉德反应是食品加工中广泛存在的反应,不仅促进食品风味,改善食品色泽,对食物过敏原的免疫活性也有一定的影响。本研究拟建立并优化鱼类主要过敏原PV美拉德反应的条件,并分析美拉德反应对PV的免疫学性质、消化稳定性及结构的影响,以期为开发低致敏性鱼类食品提供一定的理论依据。利用构建的重组PV(Recombinant Parvalbumin,rPV)表达菌株[BL21/pET-28a-PV],表达纯化出rPV;以糖种类、糖添加量、反应时间为变量,以反应产物的聚合情况及褐变度为监测指标,优化了rPV的美拉德反应条件:rPV:葡萄糖/木糖(w/w)=1:8,100°C条件下反应100 min。对rPV美拉德产物性质的分析结果显示,美拉德反应后rPV的含糖量、荧光强度均明显增加;Dot blotting分析表明,美拉德反应降低了rPV的IgG结合活性。采用QE-MS/MS分析表明,在该反应条件下rPV的第55、84、88、97、108位赖氨酸残基发生了糖化修饰,其中第88、97、108位赖氨酸残基位于IgE结合表位区域,连接在赖氨酸残基上的糖链可能对表位产生直接的封闭效应,从而降低了小清蛋白的致敏性。圆二色谱分析结果表明,美拉德反应后rPV无规则卷曲的百分含量降低;ANS疏水性荧光探针检测结果显示美拉德反应后rPV疏水性增加;扫描电镜结果显示,糖化后的rPV互相交联形成网络结构,这些蛋白结构的改变可能也是影响rPV免疫活性的重要原因之一。利用rPV优化的美拉德反应条件,进一步研究糖化对天然小清蛋白免疫活性及结构的影响。以厦门产海洋鱼类灰星鲨(Mustelus griseus)为研究对象,利用硫酸铵盐析及连续柱层析(DEAE-Sepharose、Sephacryl S-200 HR)从灰星鲨鱼肉中分离纯化得到分子量分别为14 kDa和12 kDa两个亚型的小清蛋白(SPVI,SPVII)。分别对其在蛋白:葡萄糖(w/w)=1:8,100°C条件下反应100 min进行美拉德反应。美拉德反应后SPVI、SPVII的IgG结合活性均降低,消化稳定性增加,二级结构部分丧失,疏水性增加。进一步采用RBL-2H3细胞模型评价美拉德反应对SPVs致敏性的影响,通过测定脱颗粒情况以及组胺、IL-4、TNF-α的分泌量变化,证实美拉德反应可降低SPVs的免疫活性。在此基础上,利用美拉德反应结合高压处理制备低致敏性鲨鱼鱼松。Dot blotting分析表明,与对照组相比,采用高压结合美拉德反应制备的鲨鱼鱼松IgG结合活性基本消失。采用Balb/c小鼠致敏模型证实,高压处理结合美拉德反应制备的鲨鱼鱼松与对照组相比,可以减轻小鼠过敏症状、减缓直肠温度下降并抑制Th2脾脏淋巴细胞细胞因子分泌,表明采用高压结合美拉德反应制备的鲨鱼鱼松具有较低的致敏性。