论文部分内容阅读
目的:胶原三螺旋重复蛋白-1（collagen triple helix repeat containing-1,CTHRC1）是一种参与胶原基质形成的基因,本课题的研究目的为:（1）检测正常及慢性牙周炎（chronic periodontitis,CP）牙龈组织中CTHRC1的表达和分布特点,了解CTHRC1是否在炎症牙龈组织中表达及参与炎症进展。（2）牙龈卟啉单胞菌脂多糖（porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide,P.g LPS）刺激人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament fibroblast,hPDLFs）,探究炎症刺激对成纤维细胞CTHRC1表达的调控作用。（3）通过siRNA干扰（small interfering RNA,siRNA）技术探究CTHRC1对细胞增殖、迁移、成骨分化的相关作用。方法:（1）分别切取正常牙龈组织（15例）和慢性牙周炎牙龈组织（30例）,常规固定、脱水、包埋,连续切片后分别进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色和免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）染色,对CTHRC1蛋白表达位点进行定位,通过图像软件Image Pro Plus 6.0处理后进行半定量分析。（2）收集12～19岁患者新鲜拔除的无龋年轻恒牙（前磨牙或第三磨牙）,刀背快速刮取根中1/3的牙周膜组织,联合消化法进行原代培养,采用免疫荧光（immunofluorescence,IF）染色技术鉴定细胞来源。取生长良好的3～5代hPDLFs,分别使用含10%FBS的α-E培养基（完全培养基）和含1、5、10μg/mL P.g LPS的完全培养基培养24和48 h,CCK-8实验检测细胞增殖水平,酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assays,ELISA）检测细胞上清CTHRC1蛋白浓度,实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测细胞中CTHRC1m RNA水平的表达,了解体外模拟的炎性刺激下hPDLFs中CTHRC1的表达特点,依据上述实验结果设计第三部分实验并进行细胞功能的相关检测。（3）分别将siRNA-NC（阴性对照组基因）和si CTHRC1（目的基因）转入hPDLFs,转染后1、2、5、7、9 d检测细胞内CTHRC1在m RNA水平的表达。转染成功的siRNA-NC组和si CTHRC1组细胞分别培养于完全培养基和含有5μg/mL P.g LPS的完全培养基中,形成正常阴性对照组（control-NC组）、正常沉默组（control-si CTHRC1组）、炎症阴性对照组（P.g LPS-NC组）、炎症沉默组（P.g LPS-si CTHRC1组）。通过CCK-8实验检测各组间增殖差异,细胞划痕实验检测各组划痕细胞间距离的相关变化,并检测基质分泌相关因子（COL1A1、TGF-β1）和早期成骨分化相关因子（COL1A1、ALP）的表达。结果:（1）相较于正常组,慢性牙周炎组牙龈组织出现上皮细胞连接不紧密、上皮钉突延伸、固有层大量炎症细胞浸润等病理改变。IHC实验结果表明,CTHRC1在慢性牙周炎牙龈组织中表达,其阳性表达面积和强度较正常组均显著增加。（2）原代hPDLFs于7～10天从组织边缘爬出,向组织周围生长,细胞形态呈梭形或多角形。波形蛋白表达阳性,角形蛋白阴性,表明细胞来源于中胚层,鉴定为hPDLFs。CCK-8结果表明同一检测时间各浓度组细胞增殖水平相当,差异无显著性,排除了因细胞增殖水平不同导致后续检测的准确度偏差。ELISA实验结果表明细胞外CHTRC1水平主要与P.g LPS有关,以对照组为基准,1μg/mL浓度组对细胞外蛋白水平无促进作用,5和10μg/mL浓度组可刺激诱导细胞外CTHRC1水平升高,其中10μg/ml浓度组在48 h检测时差异具有显著性（P<0.05）;比较P.g LPS各浓度组可见细胞外蛋白水平与刺激浓度呈正相关关系。qRT-PCR结果表明,5和10μg/mL P.g LPS培养24和48 h CTHRC1表达显著升高,其中以5μg/ml P.g LPS诱导最为显著。（3）细胞转染6 h后镜下可见荧光标记表达表明转染成功,转染后1～7天CTHRC1敲低效率均可达95%以上。CCK-8结果表明,正常情况下细胞沉默CTHRC1增殖水平下降,第3天检测差异具有显著性（P<0.001）;炎症情况下细胞沉默CTHRC1增殖水平下降,第3和5天检测差异均具有显著性（P<0.001）。细胞划痕实验结果表明正常沉默细胞CTHRC1后细胞迁移能力下降,12和24 h检测具有显著差异（P<0.01）;炎症情况下沉默细胞CTHRC1后细胞迁移能力增强,12和24 h检测具有显著差异（P<0.01）。常规细胞培养48 h检测发现COL1A1和TGF-β1在正常和炎症刺激下均受到CTHRC1的抑制,炎症作用下抑制作用增强;成骨诱导分化过程中,CTHRC1影响COL1A1和ALP的表达。因此CTHRC1对各因子的调控作用受到炎症刺激的干扰,与正常情况相比可能产生不同的作用效果。结论:CTHRC1在炎症组织中的表达面积和强度显著高于正常组,这可能与慢性牙周炎牙龈组织中多种细胞可产生CTHRC1并分泌至细胞外基质有关。体外细胞实验表明P.g LPS刺激可诱导hPDLFs表达CTHRC1,表达水平主要与刺激浓度相关。细胞功能相关检测表明CTHRC1对正常hPDLFs的增殖、迁移、胶原合成及成骨分化方面具有调控作用,而在炎症作用下具体作用效果可能发生改变,从而由对细胞正常生理功能的调控变为参与炎症发展和组织的损伤。