倍半萜合酶催化反应起始为法尼基焦磷酸裂解二磷酸部分,导致不稳定的萜烯碳正离子。随后,倍半萜合酶中底物结合位点的催化轮廓引发并引导级联的碳正离子反应(例如,双键迁移,氢化物和甲基转移或去质子化),从而导致单一萜烯或多种萜烯的合成。对于倍半萜合酶的突变研究能够鉴定蛋白质氨基酸序列对酶催化效率和产物特异性的影响,进一步阐明倍半萜合酶的催化机理,在实际应用中可为新的药物前体的开发提供理论指导。倍半萜类合酶的催化机制中存在限速步骤,一例研究发现(E,E)-FPP向NPP的异构化过程是限制Trichodiene合酶(FSTS)催化反应途径中化学催化速率的步骤,有报道,理论计算发现(E,E)-FPP异构化为transoid(R,E)-NPP的过程为吸热反应。酶的催化活性和动力学行为是生物化学和生物技术研究中非常重要的内容。目前对倍半萜合酶限速步骤的研究很少,而明确限速步骤,可以指导定点突变,提高酶的催化活性。等温滴定量热法可用于测量酶动力学参数及热力学参数。因为随着反应的进行而产生的热能是直接且敏感的可观察事件,该方法的原理是通过酶与底物的化学滴定实验,记录化学反应吸/放热随时间的变化以确定酶促反应的动力学行为和热力学行为。为了系统研究倍半萜合酶的催化反应动力学和热力学特征,本课题以AaADS、LdBOS、ZoBS、ZmTPS4四种催化反应具有代表性的倍半萜合酶为研究对象,分析其催化反应动力学和热力学,探讨倍半萜合酶催化机制的特点,并对RXR基序进行点突变,进一步探讨RXR基序在倍半萜合酶催化机制中的作用。得到以下实验结果。AaADS、LdBOS、ZoBS、ZmTPS4的RXR基序中第一个R突变为K后,四种倍半萜合酶催化(E,E)-FPP生成萜醇的种类或含量增加;AaADS-R262A催化(E,E)-FPP无产物,LdBOS-R260A,ZoBS-R266A,ZmTPS4-R271A催化(E,E)-FPP产物量大幅减少,酶的活性减弱。ZoBS和ZmTPS4催化(E,E)-FPP和催化(S,E)-NPP的反应焓变值均为负数,且前者焓变绝对值大于后者;与ZoBS和ZmTPS4催化(S,E)-NPP生成一分子产物的所需时间相比,ZoBS和ZmTPS4催化(E,E)-FPP生成一分子产物的所需时间更长。从酶学特性、酶与底物之间的关系等方面分析,综合得出以下结论:1动力学研究表明倍半萜合酶催化FPP转变为NPP的过程是限制酶催化反应途经中化学催化速率的步骤;2热力研究表明倍半萜合酶催化FPP生成产物的过程放出热量,且FPP转变为NPP的焓变值是负数,发现FPP转变为NPP的过程是放热反应。