尽管体细胞核移植在许多物种中获得成功，但是获得表型正常克隆动物的效率却非常低。供体细胞核的不完全重序被认为是造成克隆胚胎不能正常发育到成年的首要原因。深入探讨成年体细胞克隆动物中潜在的表观遗传修饰机制，将有助于了解关于克隆动物能够正常发育的后成重序界限，强化SCNT中相关的伦理观念。本研究以成年体细胞克隆山羊为研究对象，运用同源扩增、PCR克隆测序方法获得山羊印迹基因差异甲基化(DMR)序列，并通过Southern杂交、实时定量RT-PCR、SSCP等技术，进一步探索了成年克隆山羊印迹基因、DNA重复序列的甲基化模式，端粒长度以及生长相关印迹基因和非印迹基因的表达特征，深入探讨甲基化对基因表达的调控模式。 1．山羊H19/IGF2和IGF2R第2内含子DMR的克隆测序与分析 本实验根据绵羊的DNA序列AJ566210保守区域设计引物扩增出山羊H19基因第一外显子上游长4.2kb的调控区域序列，经生物信息学分析，该序列具有和绵羊、人类和小鼠同样的结构(Genbank登录号：EF577239)。包含有4个锌指蛋白CTCF结合位点，分别定位于转录起始部位上游4079bp(Ⅰ)、3646bp(Ⅱ)、2866bp(Ⅲ)和1221bp(Ⅳ)；4个CpG岛，GC含量分别为63％、65％、61％和71％；该序列与绵羊的参考序列同源度达93.5％。 根据绵羊DNA序列AY182033保守区域设计引物扩增出山羊IGF2R第二内含子DMR片段，并成功获得上游809bp和下游576bp序列(中间区域由于GC含量过高，无法测序；Genbank登录号：EF577240)。经BLAST分析确认，与所参照序列同区域同源度平均为95.7％，GC含量分别为76％和67％。 2．成年体细胞克隆山羊H19和IGF2R基因DMR甲基化状况分析 基因组DNA10μg用EcoR Ⅰ和甲基化敏感酶SacⅡ酶切后，与筛选出的H19基因上游特异性探针(地高辛标记)进行Southern杂交。结果表明，在H19基因上游DMR，成年体细胞克隆山羊甲基化程度均值(1.85±0.37)与年龄相近的对照组山羊均值(1.53±0.38)相比，差异不显著；但是就个体而言，克隆山羊只有一只甲基化水平不在对照组均值范围内；卵巢颗粒细胞克隆山羊均值(1.84±0.39)与皮肤成纤维细胞克隆山羊均值(1.90±0.47)基本接近，表明不同的供核细胞类型来源并没有对其甲基化状况有什么影响；皮肤成纤维细胞克隆山羊平均值稍低于其供核体山羊。为了检测成年体细胞克隆山羊IGD2R第2内含子DMR的甲基化状态，基因组DNA10μg用HindⅢ和甲基化敏感酶sacⅡ酶切，Southem转移后与特异性探针杂交。结果表明，成年克隆山羊甲基化均值(4.46±1.67)与年龄相近的对照组山羊均值(2.34±1.28)相比，差异显著，表明成年克隆山羊IGF2R基因内含子差异甲基化区域甲基化水平显著高于同龄对照组动物；卵巢颗粒细胞克隆山羊均值(4.54±1.91)与2只皮肤成纤维细胞克隆山羊均值(4.19±0.99)基本接近，因此，在这个差异甲基化位点上，不同的供核细胞类型并没有对其甲基化状况影响不大；皮肤成纤维细胞克隆山羊平均值则与其核供体山羊的甲基化程度相当。 3．成年体细胞克隆山羊小卫星DNA重复序列甲基化状况分析 基因组DNA 5μg平均分成2等份，分别用甲基化不敏感内切酶Msp Ⅰ消化和甲基化敏感性限制酶HpaⅡ消化后与人源小卫星探针33.6杂交。结果表明，成年体细胞克隆山羊小卫星DNA重复序列甲基化程度与自然繁殖山羊相比差异不显著；成纤维细胞克隆山羊甲基化水平(6.17±1.46)少于颗粒细胞克隆山羊的均值(6.89±4.15)，也低于其皮肤成纤维细胞供体山羊的7.96，但是颗粒细胞克隆变异系数较高。 4．体细胞克隆山羊端粒长度分析 本实验用TRF法检测了成年体细胞克隆山羊端粒长度。结果表明，成年克隆山羊耳皮肤组织端粒平均长度与同龄对照相比，差异不显著，但是克隆山羊的变化范围较大；皮肤成纤维克隆山羊端粒长度略大于卵巢颗粒细胞；继代克隆山羊端粒长度略短于对照，但差异不显著。说明核移植以及连续核移植对克隆山羊端粒长度影响不大。 5．成年体细胞克隆山羊生长相关印迹基因表达分析 本实验用Real-time PcR分析了成年体细胞克隆山羊印迹基因H19、IGF2和IGF2R mRNA表达情况。结果表明，克隆山羊和非克隆山羊J19基因和IGF2基因的表达并没有显著差异，而IGFR基因的表达水平核移植山羊极显著高于普通山羊。2只皮肤成纤维细胞克隆山羊H19和IGF2基因的表达明显低于颗粒细胞克隆山羊中的表达量，而IGF2R基因的表达在二者中的表达基本相同。同时本实验还H19和IGF2基因的定量PCR产物进行SSCP分析，结果表明，二者的单等位表达方式是一致的。 本实验还获得了山羊IGF2基因完整编码区和3’非翻译区。分析表明，山羊IGF2基因开放阅读框(ORF)长度为540bp，编码一个179氨基酸的蛋白。三种反刍动物相比，山羊IGF2 DNA序列与绵羊的同源性(99.47％)要高于牛(97.68％)。编码的氨基酸序列与绵羊同源性(98.88％)也高于牛(96.09％)。山羊IGF2基因GenBank登陆号为DQ645739。同时还获得山羊H19和IGF2R基因部分序列，GenBank登陆号分别为：DQ666955和DQ666954。 6．成年体细胞克隆山羊生长相关非印迹基因表达分析 本实验用Real-time PCR分析了成年体细胞克隆山羊非印迹基因IGF1、IGF1R、GHR和GHSR mRNA表达情况。结果表明，克隆山羊和非克隆山羊IGF1、GHR和GHSR基因的mRNA表达量差异不显著，而IGF1R基因的表达水平核移植山羊极显著高于普通山羊。本实验同时还获得山羊IGF1R基因部分序列，GenBank登陆号为：DQ666953。