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一、研究目的借助支气管上皮细胞(16HBE细胞)、气道平滑肌细胞(ASMC)两种细胞,从抗炎、抗氧化、抑制细胞增殖等方面研究肺衰合剂的治疗作用,揭示肺衰合剂治疗慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的机制,为中医治疗COPD新靶点提供理论及科学依据。二、研究方法本课题实验分为两部分:第一部分以香烟烟雾提取物(Cigarette smoke extract,CSE)刺激16HBE细胞构建COPD模型,进一步进行中药肺衰合剂血清、空白血清干预培养处理。采用CCK-8法测定不同浓度CSE对16HBE细胞活力的影响;以酶联免疫吸附实验(ELISA)测定16HBE细胞中IL-8蛋白表达;以实时定量PCR(RT-PCR)测定16HBE细胞中IL-8m RNA表达;通过荧光素报告基因系统测定IL-8转录活性;以蛋白免疫印迹测定16HBE细胞中迁移蛋白水平。研究肺衰合剂对CSE诱导后16HBE细胞IL-8m RNA及蛋白表达的作用。第二部分以CSE刺激ASMC细胞构建COPD模型,进一步进行中药肺衰合剂血清、N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)、Mito Q10干预培养处理。通过MTG-DAPI染色法测定ASMC细胞内线粒体;通过流式细胞术测定细胞周期,研究肺衰合剂对CSE诱导后ASMC细胞线粒体损伤及细胞周期的影响。三、结果1.CCK-8检测结果:在1%CSE组、2.5%CSE组、5%CSE组、7.5%CSE组、10%CSE组中,随着CSE浓度的增高,16HBE细胞和ASMC细胞的活力下降均不明显(P>0.05);之后15%CSE组、20%CSE组两者细胞活力都呈明显下降趋势(P<0.05)。2.RT-PCR与Elisa检测结果:在无任何刺激下16HBE细胞IL8m RNA和蛋白表达水平较低;与空白对照组相比,以10%CSE刺激16 HBE细胞12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h后,细胞内IL-8 m RNA和蛋白表达升高明显,差异均具有统计学意义(P<0.05)。经血清干预后,和CSE组16 HBE细胞相比较,空白血清对照组IL-8m RNA和蛋白含量变化没有统计学意义(P>0.05);和空白血清对照组做对比,含药血清组IL-8m RNA和蛋白含量显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);3.荧光素报告基因系统测定结果:与CSE细胞组相比,空白血清对照组16HBE细胞IL-8转录活性没有统计学意义(P>0.05);和空白血清对照组进行对比,含药血清组IL-8转录活性明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.Western-Blot检测结果:中药肺衰合剂可抑制10%CSE刺激下16HBE细胞N-cadherin、Vimentin的表达,同时增强E-cadherin的表达,这种对16HBE上表达迁移相关蛋白的作用随着浓度的上涨而增强。5.MTG-DAPI染色法结果:2.5%CSE组和空白模型组对比,ASMC细胞荧光强度较之显著下降;而NAC对照组与中药干预组细胞内显示荧光强度较2.5%CSE组增强,但仍低于空白模型组。6.流式细胞术检测结果:与空白模型组相比,2.5%CSE组ASMC细胞G1/G0比例较之下降,S期比例较之增多;与2.5%CSE组相比,经NAC、Mito Q10以及中药各个剂量干预后的ASMC细胞G1/G0期比例明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。四、结论1.香烟烟雾提取物可浓度依赖性的抑制16HBE细胞活性,上调16HBE细胞内IL-8m RNA和蛋白表达,并诱导16HBE细胞发生上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)。2.中药肺衰合剂可逆转CSE对16HBE细胞IL-8m RNA和蛋白表达水平的调控作用,抑制EMT发生。3.香烟烟雾提取物可浓度依赖性的抑制ASMC细胞活性,能够通过诱导ASMC细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的产生造成线粒体损伤,并能促进ASMC细胞分裂增殖。4.中药肺衰合剂可有效降低ASMC细胞内ROS的累积、抑制线粒体损伤、抑制细胞增殖,其有效性不劣于抗氧化剂NAC。5.中药肺衰合剂治疗COPD的机制涉及对炎症反应、氧化应激与细胞增殖的调节作用。