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研究背景吸入全麻药,如七氟烷,已在临床广泛使用,但其如何引起意识消失以及意识恢复的具体机制至今仍不清楚。解析其作用机制不仅有利于提高全麻质量及安全性,更有利于进一步推动对意识形成相关神经活动的理解。随着对睡眠-觉醒调节的神经网络机制的进一步研究,近年学者认为全麻药物也可通过作用于多个不同脑区特定靶点调节特定的神经递质发挥麻醉-觉醒调节的作用,而不同脑区之间形成的神经网络可共同调节麻醉-觉醒状态的转换。但启动麻醉-觉醒调节相关多个脑区和多种神经递质协同作用的关键靶点及其神经环路在何处目前尚不清楚。2018年Science杂志报道:丘脑室旁核（Paraventricular thalamus,PVT）谷氨酸能神经元是维持觉醒的关键,且在异氟烷麻醉下,光遗传激活小鼠PVT谷氨酸能神经元可促行为学及脑电觉醒。PVT主要为谷氨酸能神经元,可接收来自臂旁核（Parabrachial nucleus,PBN）,中脑导水管周围灰质（Periaqueductal gray,PAG）,中缝背核（Dorsal raphe nucleus,DR）,外侧下丘脑（Lateral hypothalamus,LH）等与睡眠/麻醉-觉醒调节相关核团的神经投射,且其神经纤维可广泛投射至边缘系统及其相关脑区。但PVT谷氨酸能神经元是否与七氟烷诱导、维持、苏醒过程以及麻醉敏感性有关仍未可知,且PVT谷氨酸能神经元具体向下游哪些脑区及其特定神经元类型进行投射,以及形成何种调控通路从而介导麻醉-觉醒状态转换,鲜有报道。终纹床核（Bed nucleus of the stria terminalis,BNST）位于边缘前脑,主要通过投射到自主神经系统的中继核、下丘脑以及中央杏仁核等区域调控多种内分泌及自主神经反应,在应激、恐惧和焦虑等行为中发挥重要作用。光遗传或化学遗传学激活BNST的GABA能神经元均可促进小鼠从非快速眼动睡眠迅速向觉醒状态转换。此外,PVT的钙网膜蛋白（Calretinin,CR）阳性神经元对BNST有直接投射,PVTCR+-BNST神经环路介导饥饿促觉醒行为。近来研究证实了全身麻醉与睡眠-觉醒存在部分共同的神经环路机制。因此,我们推测PVT的谷氨酸能神经元对BNST也有投射,且可通过激活BNST的GABA能神经元调节七氟烷麻醉-觉醒状态的转换。基于以上科学问题,本课题组通过使用转基因小鼠,采用电生理、光/化学遗传学、病毒示踪、免疫荧光等技术,研究了PVT谷氨酸能神经元在七氟烷麻醉诱导、维持及苏醒过程中的作用,解析了PVT-BNST之间的突触联系,并探究了PVT-BNST神经环路在七氟烷麻醉-觉醒神经网络调节中的作用,且进一步探究了PVT-BNST神经环路对疼痛及焦虑行为的影响,为完善七氟烷的网络调控机制及进一步开发更安全有效且高质量的全麻药物提供了理论依据。方法和结果第一部分PVT谷氨酸能神经元在七氟烷麻醉诱导、维持及觉醒中的作用方法:首先,采用c-Fos免疫荧光染色揭示PVT脑区在七氟烷麻醉下神经元活性的变化。其次,使用化学遗传学抑制PVT谷氨酸能神经元,观察其对七氟烷诱导及苏醒的行为学及脑电特征的影响。最后,使用光遗传学技术兴奋PVT谷氨酸能神经元,进一步验证PVT对七氟烷诱导及苏醒行为学的影响,并探究其对七氟烷麻醉维持期行为学及脑电爆发抑制的影响。结果:1.免疫荧光结果显示,与清醒组相比,PVT区神经元在七氟烷麻醉下c-Fos的表达明显降低（p<0.001）。2.行为学结果显示,在七氟烷诱导过程中,与对照组（h M4D-saline组和m CherryCNO组）分别相比,化学遗传学特异性抑制PVT谷氨酸能神经元（h M4D-CNO组）可明显缩短七氟烷翻正反射消失的时间即诱导时间（154.0±23.22 s vs.116.4±36.02 s,p<0.05;162.8±22.36 s vs.116.4±36.02 s,p<0.01）,并显著延长翻正反射恢复时间即苏醒时间（157.3±40.76s vs.266.5±84.22 s,p<0.001;168.9±45.08s vs.266.5±84.22 s,p<0.001）,且抑制PVT谷氨酸能神经元使七氟烷诱导剂量与LORR效应曲线及七氟烷苏醒剂量与RORR效应曲线均左移。3.与对照组h M4D-saline组相比,化学遗传特异性抑制PVT谷氨酸能神经元（h M4DCNO组）使七氟烷麻醉诱导期delta频段能量明显增加（p<0.01）,其余频段的差异无统计学意义。在七氟烷麻醉苏醒期,与对照组h M4D-saline组相比,h M4DCNO组delta频段能量明显增加（p<0.0001）,theta频段能量降低（p<0.01）,其余频段的差异无统计学意义。4.在七氟烷诱导过程中,与对照组（Ch R2-off组和m Cherry-on组）分别相比,光遗传激活PVT谷氨酸能神经元（Ch R2-on组）可增加七氟烷翻正反射消失时间（138.4±32.53 s vs.187.6±30.27s,P<0.05;143.5±27.59 s vs.187.6±30.27 s,p<0.05）。在七氟烷苏醒过程中,与对照组（Ch R2-off组和m Cherry-on组）分别相比,光遗传学激活PVT谷氨酸能神经元（Ch R2-on组）可明显缩短七氟烷翻正反射恢复时间（165.9±52.20 vs.101.5±26.59 s,p<0.05;158.5±32.55 s vs.101.5±26.59 s,p<0.05）。5.在七氟烷浅麻醉维持期,光遗传激活PVT谷氨酸能神经元可促行为学觉醒。在七氟烷诱导爆发抑制状态下,光遗传激活PVT谷氨酸能神经元可显著增加七氟烷爆发抑制中的脑电爆发的持续时间及频率,并使爆发抑制率（Burst-suppression ratio,BSR）从57±0.18%显著下降至14±0.09%,p<0.001),且脑电频谱分析显示delta、alpha、beta和gamma频段能量明显增加（p<0.05）。第二部分PVT-BNST神经环路的结构鉴定方法:首先将Cre依赖表达的顺向示踪病毒AAV-EF1α-DIO-Ch R2-m Cherry微量注射至vglut2-Cre小鼠的PVT区中,探究小鼠PVT谷氨酸能神经元的下游投射脑区,并通过辅助病毒及改造后的狂犬病毒和两种转基因小鼠（vgat-Cre:标记GABA能神经元和vglut2-Cre:标记谷氨酸能神经元）进行细胞特异性逆向跨单突触示踪,再结合vglut2荧光染色,以观察PVTvglut2+神经元对BNST的GABA能神经元和谷氨酸能神经元是否有直接投射。结果:BNST脑区可接受来自PVT谷氨酸能神经元的直接投射,BNST的GABA能神经元和谷氨酸能神经元都接受上游PVT核团的直接输入,且支配BNST的GABA能神经元和谷氨酸能神经元的PVT神经元绝大多数是vglut2+。第三部分特异性调控PVT-BNST神经环路对七氟烷麻醉诱导、维持及觉醒的影响方法:采用化学遗传学特异性抑制PVT-BNST神经环路,观察其对七氟烷诱导及苏醒的行为学及脑电特征的影响。再使用光遗传兴奋PVTvglut2+-BNST神经环路,观察其对七氟烷诱导及苏醒行为学的影响,并探究其对七氟烷麻醉维持期行为学及脑电爆发抑制的影响。结果:1.行为学结果显示,在七氟烷麻醉诱导期,h M4D-CNO组（87.17±24.00 s）的翻正反射消失的时间明显短于h M4D-saline组（135.8±35.96 s,p<0.01）和m CherryCNO组（123.7±28.64 s,p<0.05）。七氟烷麻醉苏醒期,h M4D-CNO组（292.4±108.4 s）的翻正反射恢复时间明显长于h M4D-saline组（174.2±58.68 s,p<0.01）和m Cherry-CNO组（159.8±72.54 s,p<0.001）。而且,化学遗传学抑制PVT-BNST神经环路（h M4D-CNO组）可使LORR和RORR量效曲线均较对照组（h M4Dsaline组和m Cherry-CNO组）明显左移。2.脑电结果显示,与对照组相比,化学遗传学特异性抑制PVT-BNST神经环路可使七氟烷麻醉诱导期delta频段能量明显增加（p<0.0001）,使七氟烷麻醉苏醒期delta频段能量明显增加（p<0.01）,其余频段的差异无统计学意义。3.在七氟烷诱导期,与对照组Ch R2-off组和m Cherry-on组相比,光遗传学兴奋PVTvglut2+神经元投射到BNST的神经末梢,即Ch R2-on组可延长七氟烷翻正反射消失时间（103.3±36.41 s vs.153.6±24.46 s,P<0.05;109.3±32.84 s vs.153.6±24.46 s,P<0.05）。在七氟烷苏醒期,光遗传学激活PVTvglut2+-BNST神经环路,即Ch R2-on组（106.9±22.47 s）较Ch R2-off组（168.6±40.53 s,p<0.05）和m Cherryon组（159.5±34.38 s,p<0.05）的七氟烷翻正反射恢复时间明显缩短。4.在七氟烷浅麻醉维持期,光遗传激活PVTvglut2+-BNST神经环路可促行为学觉醒。在七氟烷诱导爆发抑制状态下,光遗传学特异性激活PVTvglut2+-BNST神经环路可显著增加七氟烷爆发抑制中的脑电爆发的持续时间及频率,并显著降低爆发抑制率,从43±0.10%降至3±0.40%（p<0.0001）。脑电频谱分析显示delta频段能量明显增加（p<0.05）,其余频段的差异无统计学意义。第四部分PVT-BNST神经环路对疼痛及焦虑负面情绪的影响方法:采用化学遗传学特异性抑制PVT-BNST神经环路,或光遗传学特异性兴奋PVTvglut2+-BNST神经环路,并通过采用von Frey丝测定机械阈值以及热平板实验测定热潜伏期阈值来观察其对疼痛行为学的影响,通过旷场实验及高架十字实验观察其对焦虑行为学的影响。结果:1.化学遗传学抑制PVT-BNST神经环路对旷场运动总距离及待在旷场中心的时间无明显影响,但可明显增加小鼠在高架十字迷宫实验中进入开放臂的时间及次数。2.光遗传学兴奋PVTvglut2+-BNST神经环路对旷场运动总距离无明显影响,但明显减少进入旷场中心的时间,且明显减少小鼠在高架十字迷宫实验中进入开放臂的时间及次数。3.化学遗传学抑制或光遗传学兴奋PVT-BNST神经环路对机械阈值及热痛潜伏期均无明显影响。结论1.PVT谷氨酸能神经元参与七氟烷诱导、维持、苏醒及麻醉敏感性的调控。2.PVT谷氨酸能神经元对BNST的GABA能神经元和谷氨酸能神经元都有突触联系。3.PVT-BNST神经环路参与七氟烷诱导、维持、苏醒及麻醉敏感性的调控。4.PVT-BNST神经环路可参与调控焦虑样行为,但对疼痛调控无明显影响。