【摘 要】
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目的:研究TCF21调控KISS1经Wnt/β-catenin信号通路抑制结直肠癌细胞转移的机制。方法:1.免疫组织化学染色和实时荧光定量PCR检测结直肠癌及相应的癌旁正常组织中TCF21和KISS1基因的蛋白表达水平和m RNA表达水平。2.实时荧光定量PCR检测结直肠癌细胞株中TCF21 m RNA表达水平,选取TCF21表达量最低的细胞株转染过表达慢病毒构建过表达细胞株,取TCF21表达量最
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目的:研究TCF21调控KISS1经Wnt/β-catenin信号通路抑制结直肠癌细胞转移的机制。方法:1.免疫组织化学染色和实时荧光定量PCR检测结直肠癌及相应的癌旁正常组织中TCF21和KISS1基因的蛋白表达水平和m RNA表达水平。2.实时荧光定量PCR检测结直肠癌细胞株中TCF21 m RNA表达水平,选取TCF21表达量最低的细胞株转染过表达慢病毒构建过表达细胞株,取TCF21表达量最高的细胞株转染干扰慢病毒构建敲减细胞株;应用实时荧光定量PCR、蛋白印迹法对比确认转染前后各组细胞株中TCF21基因m RNA和蛋白是否稳定表达或敲低,将实验组分为空白对照组（CON）、过表达组（TCF21）、敲减组（sh TCF21）和空载体组（NC）进行后续实验。3.蛋白印迹实验检测各组细胞TCF21、KISS1及WNT3a、β-catenin,N-cadherin的蛋白表达水平;CCK-8实验检测各组细胞增殖活力;细胞划痕实验检测各组细胞的迁移能力;Transwell小室检测各组细胞的侵袭能力。4.KISS1过表达慢病毒转染TCF21敲减组,检测该组细胞TCF21、KISS1及WNT3a、β-catenin,N-cadherin表达量,以及增殖、迁移、侵袭能力。结果:1.在结直肠癌中,TCF21和KISS1的蛋白和m RNA表达水平显著低于癌旁正常组织（P<0.001）。2.实时荧光定量PCR实验结果显示在4株细胞株（SW480、LOVO、SW620、HCT116）中,HCT116中TCF21表达量最低,SW480中TCF21表达量最高。在HCT116细胞中过表达TCF21后,与对照组相比,TCF21m RNA和蛋白的表达量显著升高（P<0.001）;在SW480中沉默TCF21后,与对照组相比,TCF21m RNA和蛋白的表达量显著降低（P<0.001）,提示过表达组和敲减组构建成功。3.蛋白印迹实验结果示,与对照组相比,TCF21过表达组中KISS1表达显著升高（p<0.001）,WNT3a、β-catenin、N-cadherin的表达显著降低（p<0.001）;而TCF21敲减组的KISS1的表达量显著降低（P<0.001）,β-catenin、WNT3a、N-cadherin表达量则显著升高（P<0.001）。在TCF21敲减组中过表达KISS1后,相较于TCF21敲减组,KISS1的表达水平增高的同时β-catenin、WNT3a、N-cadherin的表达显著降低（p<0.001）。4.CCK-8细胞增殖实验,TCF21过表达组24h、48h和、72h后所测得的OD值均低于对照组各时段的OD值（p<0.05）,表明细胞增殖活力减弱;TCF21敲减组24h、48h和、72h的OD值均高于对照组各时段的OD值（p<0.05）,表明细胞增殖活力增强;在TCF21敲减组中过表达KISS1后细胞增殖活力部分逆转（p<0.05）。5.细胞划痕实验,与对照组相比,TCF21过表达组细胞在24h后迁移率显著降低（P<0.05）;TCF21敲减组的迁移率显著升高（p<0.01）;在TCF21敲减组中过表达KISS1后,细胞迁移率降低（p<0.05）。6.Transwell小室侵袭实验,与对照组相比,TCF21过表达组细胞穿透进入下层小室的数量显著减少（p<0.001）;TCF21敲减组细胞进入下层小室的数量显著增加（p<0.001）;在TCF21敲减组中过表达KISS1后,穿透进入下层小室的数量减少（p<0.001）。结论:1.结直肠癌组织中TCF21和KISS1表达量降低,且TCF21与KISS1表达呈正相关。2.TCF21可能通过促进KISS1的表达经Wnt/β-catenin信号通路抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
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