【摘 要】
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微囊藻毒素(Mcirocystins,MCs)是一类水体环境中最常见的单环七肽蓝藻毒素,其中以亚型微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR,MC-LR)分布范围最广、急性毒性最强。MC-LR化学性质非常稳定,耐高温、强酸和强碱,常规处理方法无法去除。动物及人体肝脏、肾脏为其累积和作用的靶器官,所以MC-LR也是一种强致肝癌因子。MC-LR不仅能够直接危害淡水生物,还可以通过径流转移到近海海域
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微囊藻毒素(Mcirocystins,MCs)是一类水体环境中最常见的单环七肽蓝藻毒素,其中以亚型微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR,MC-LR)分布范围最广、急性毒性最强。MC-LR化学性质非常稳定,耐高温、强酸和强碱,常规处理方法无法去除。动物及人体肝脏、肾脏为其累积和作用的靶器官,所以MC-LR也是一种强致肝癌因子。MC-LR不仅能够直接危害淡水生物,还可以通过径流转移到近海海域,在海水生物中累积,最终通过食物链累及人类自身健康。因此开发简便、高效、灵敏的检测方法尤其重要。本文基于适配体和纳米材料,开发了适配体胶体金比色传感器实现MC-LR的方便、快捷、灵敏检测。采用剪裁和定点突变优化适配体序列,用胶体金比色法来比较各适配体与靶标的亲和力,并用分子对接预测MC-LR与适配体的结合位点。开发了竞争模式的适配体胶体金试纸条法能够实时现场检测MC-LR。主要研究内容如下:采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,依据已报道的MC-LR的原适配体序列Apt-1,利用Mfold软件对其二级结构进行拟合分析。采用定点突变法优化适配体序列,获得与原适配体(Apt-1)结构完全不同的适配体-3(Apt-3)。基于两个适配体构建胶体金比色传感器,优化体系条件和各成分浓度。其中(Apt-1)-AuNPs体系检测MC-LR,目视检测限为70 ng/m L,Apt-3则能达到30 ng/m L;当体系Na Cl浓度为0.05 mol/L时,适配体浓度为0.06μmol/L,以Apt-3构建的AuNPs体系定量检测MC-LR,其线性范围为1-120 ng/m L,线性回归方程为y=0.0066x+0.0595(R~2=0.995),线性关系良好,其理论最低检测限为5.88 ng/m L。同时对建立的Apt-AuNPs体系的特异性进行考查,结果表明,基于适配体的胶体金比色法可以快速、简单地实现MC-LR的视觉检测。与Apt-1相比,经突变后的Apt-3依然具有高特异性,与MC-LR的亲和力提高。本研究为后续进行适配体序列与结构的优化,开发灵敏度更高的传感器奠定了基础。经过突变和合理截短MC-LR原适配体(Apt-1)得到一系列具有分段结构和序列的适配体,利用适配体胶体金比色传感器检测MC-LR,比较各适配体与MC-LR亲和力的大小。通过对原适配体和截断的适配体的结构特征和量化性能的系统研究,基于分子对接模拟技术对Apt-1以及Apt-3的结合位点的预测分析,发现20 mer的适配体Apt-2C区域为MC-LR的主要结合域。MC-LR上Adda残基的羰基和精氨酸的胍基与适配体形成氢键,此外MC-LR的D-Me-Asp和D-Glu也参与了与适配体的结合。在所有适配体中,20 mer的Apt-2C与MC-LR的结合亲和力提高,特异性良好。在最佳实验条件下,Apt-2C比色传感器在5-100 ng/m L MC-LR浓度范围内线性关系良好(R~2=0.9908),理论检出限(LOD)为0.55 ng/m L,目视检测限为10ng/m L。将该适配体Apt-2C胶体金比色传感器检测池水加样后的MC-LR浓度,在10-100 ng/m L范围内回收率为9.42%-107.5%,标准差为1.2%-5.8%。结果表明,该方法对真实水样MC-LR的测定具有较高的灵敏度和准确度。因此,本研究为MC-LR的视觉检测提供了一种快速、可靠、方便的方法,对评估海产品消费相关的潜在健康风险,对食品安全控制具有重要意义。基于适配体Apt-2C和免疫层析试纸条(Literal Flow Strip Assay,LFSA)原理建立了竞争模式的胶体金试纸条快速检测技术,并首次用于MC-LR的检测。采用氯化钠陈化法使胶体金偶联巯基化的适配体Apt-2C制成偶联复合物作为结合垫,并用Mey氏稳定试验和紫外光谱法表征。以Apt-2C的互补序列和DNA Ploy A分别作为检测线和质控线,针对试纸条的反应体系(重悬液配方、结合垫处理液、适配体偶联量、链霉亲和素与生物素化探针比例以及T、C探针浓度及之间比例)进行优化。在优化条件下,该试纸条具有较高的特异性,对MC-LR的裸眼可视检测限为50ng/m L,检测时间在15 min以内,检测范围为50-1000 ng/m L。该方法简便,准确,成本低,可实现对MC-LR的现场可视化、快速检测。
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