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猪圆环病毒2型(Porcine cirovirus type 2,PCV2)是引起猪圆环病毒病(porcine circovirus diseases,PCVD)的主要病原,严重危害猪群健康的全球性重要的传染病。近年来,国内外有关PCV2感染报道日益增多,引起人们广泛的关注。为了了解上海地区PCV2流行状况,我们对PCV2开展了流行病学调查,并对PCV2进行了遗传变异分析。我国大多数地区猪群中PCV2的感染十分普遍,PCV2可能是一种猪场常在病原体,其中PCV2与其他病原体共感染现象非常严重。本实验借助蛋白质组学和磷酸化修饰手段先从体外实验分析PCV2感染猪肺泡巨噬细胞系(porcine alveolar macrophage,PAM)后细胞因子表达和蛋白质组学变化,探讨PCV2感染诱导炎症反应的机理,具体研究内容如下:1.PCV2分子流行病学调查2014年到2015年初期间,从上海浦东、闵行、嘉定、奉贤的所有规模化猪场中的疑似PCVD患病猪群和正常猪群中采集组织样品,采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法,分别检测PCV1、PCV2。结果表明,PCV2感染阳性率为64.20%,从阳性病料中测序鉴定到10条PCV2序列,对其ORF2基因进行测序及分子遗传演化分析。结果发现,上海地区发病猪群中PCV2d为优势流行基因型,在同一猪场中同时存在PCV2d、PCV2b及PCV2e。表明PCV2不同基因型毒株在猪体内存在序列漂移现象。PCV2的ORF2同源性分析表明,本研究中的10株PCV2毒株之间同源性为90.3%~99%;10株PCV2毒株与国内毒株间同源性高达90.3%~99.3%,与国外毒株间同源性为90.0%~99.7%。表明国内、外PCV2毒株序列没有明显的地域差异。2.PCV2感染猪肺泡巨噬细胞的磷酸化蛋白质组学研究本文分别利用实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)和间接免疫荧光技术(indirect immunoinfluscent assay,IFA)检测各个时间点PCV2的病毒滴度和不同细胞因子(IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β)的mRNA表达水平,以此为依据,确定PCV2感染猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)的早期和晚期时间点,分别是24 h和60 h。利用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantificationI,iTRAQ)定量组学的方法分别在PCV2感染后的24 h和60 h时研究磷酸化蛋白质的变化。本次研究中,我们鉴定了925独特的磷酸化蛋白,24 h和60 h鉴定到692个和691个磷酸化蛋白,这些磷酸化蛋白的变化为探究PCV2免疫抑制和致病机制提供了大量信息。分析磷酸化蛋白质组学数据,我们发现PCV2在感染宿主细胞时,抑制细胞凋亡,促进自噬,可能是由于Hippo和Notch信号通路以及磷酸肌醇信号的激活,导致部分蛋白质激酶发生变化。互作网络分析发现这些PCV2诱导而产生变化的磷酸化蛋白涉及到的生物过程包括细胞装配和组成、信号转导、蛋白合成、核酸代谢、新陈代谢、细胞活动等。这些信号通路和功能网络分析有助于我们进一步理解PCV2的致病机理,本研究为PCV2感染引起的免疫抑制和致病机制提供了基础数据。