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糖尿病的发病率逐年递增,已成为继心脑血管疾病、癌症之后的严重威胁人类健康的第三大疾病。糖尿病分为胰岛素依赖型糖尿病和非胰岛素依赖型即2型糖尿病,其中2型糖尿病占总数的90-95%。2型糖尿病是一种胰岛素抵抗伴胰岛素不足,或胰岛素分泌缺陷伴有或不伴有胰岛素抵抗而导致的慢性高血糖疾病。目前,2型糖尿病药物治疗取得了一定进步,但疗效有限且很大程度上存在毒副作用。因此,筛选出见效快且无毒副作用的新药是2型糖尿病治疗的首要任务。高通量药物筛选技术是近年发展起来的一项新的药物发现技术,它结合自动化操作系统和微量灵敏的生物反应及检测系统,利用分子或细胞水平的药物筛选模型来评价化合物的生物活性。随着生命科学技术的不断发展,人们找到了与2型糖尿病相关的许多药靶基因,为2型糖尿病实现高通量药物筛选奠定了坚实的基础。 胰升血糖素样肽-1是一种前胰升血糖素衍生出来的多肽激素,能使正常人口服或静脉注射葡萄糖后增加胰岛素的分泌,因此也被称为肠促胰岛素。它是一种在消化时由肠胃系统释放出来的物质,能促进葡萄糖依赖性的胰岛素从胰腺的β细胞中释放出来。此外,GLP-1通过激发其受体产生生理功能,能明显刺激胰岛素分泌、增加胰岛素敏感性、抑制胰升血糖素水平和减慢胃的排空,对2型糖尿病和1型糖尿病均有效,而且将其用于治疗不会产生低血糖。因此,高通量筛选其受体的小分子化合物激动剂是2型糖尿病治疗的新方向。 本实验建立了GLP-1受体基因质粒和报告基因质粒,并将它们共同转染到CHO细胞、SHSY5Y细胞和HEK293细胞中,通过对EC50的测定,发现CHO细胞更适合作GLP-1R激动剂的高通量筛选。在共转染到CHO细胞后,用G418进行筛选,利用GLP-1刺激细胞株优化筛选条件,最后得到稳定的筛选细胞株和阴性对照株,建立起GLP-1R高通量药物筛选模型。筛选时,当化合物与膜表面的GLP-1受体结合后,激活GLP-1受体对应的信号级联反应,改变胞内第二信伎的表达水平,响应元件响应该变化,促进报告基因的表达,通过检测在细胞溶质中报告基因的量间接评估化合物的生物活性。 选用治疗2型糖尿病常见的500种中药,进行醇提(乙酸乙酯:乙醇=50:50)和水提(甲醇:水=70:30),建立起中药提取物库。利用所建立的筛选模型对提取物库进行检测,发现5个样品对GLP-1受体细胞株显活性,而不能激动阴性对照细胞株,排除假阳性的可能,证明此5个样品中存在GLP-1受体激动剂。