论文部分内容阅读
第一部分甲基丙二酸血症热点致病基因突变的选择和基因检测目的:甲基丙二酸血症是我国最常见的有机酸代谢障碍。该病的病因较为复杂,多种基因突变均可引起甲基丙二酰辅酶A变位酶的缺乏或其辅酶钴胺素代谢障碍,从而导致患儿发病。不同国家和地区的生化表型及基因谱不尽相同。由于山东半岛的甲基丙二酸血症发病率明显高于其他地区,拟在我地区进行甲基丙二酸血症携带者筛查,了解疾病高发原因。本研究的主要目的为:第一,通过收集我中心完成基因检测的甲基丙二酸血症患者了解我地区甲基丙二酸血症的热点基因和突变,并结合文献筛选该地区常见的突变基因和突变位点,用于进行山东半岛甲基丙二酸血症携带者筛查。第二:根据选择位点设计特异性引物,优化PCR反应条件,采用多重PCR结合二代测序的方法,旨在建立和评估适合本地区特点的热点基因突变的基因检测及大规模人群筛查的技术路线,并收集4例甲基丙二酸血症阳性样本及6例正常样本,明确检测方法的科学性和准确性。方法:收集完成基因检测的甲基丙二酸血症患儿35例,结合我国文献报道进行山东半岛甲基丙二酸血症热点基因、热点位点的选择。针对选择的突变位点,利用Primer Z软件设计PCR引物。收集甲基丙二酸血症患儿样本4例以及正常样本6例用于评估本研究建立的山东半岛甲基丙二酸血症大规模人群携带者筛查检测方法的覆盖度和准确性。采用离心柱法进行DNA提取,通过DNA的文库一次PCR特异性位点扩增、二次PCR加入生物标签,进行文库构建。采用磁珠法对每步PCR捕获DNA产物进行纯化。建库完成后通过Qubit测定及琼脂凝胶电泳评估捕获效率。对质检合格的文库进行混合、稀释,然后进行文库定量,按照标准上机步骤对富集文库进行序列读取和结果分析。结果:我中心收集甲基丙二酸血症患儿35例。其中MMACHC基因突变31例,MUT基因突变4例,结合文献报道选择MMACHC及MUT作为甲基丙二酸血症的携带者筛查基因。MMACHC基因突变中,筛查到10种基因突变,结合本中心及文献报道的等位基因频率选择其中8个热点突变位点进行检测,分别为:c.609G>A、c.658660del AAG、c.80A>G、c.217C>T、c.567568ins T、c.482G>A、c.394C>T、c.315C>G。MUT基因中共检出5种突变位点:c.729730ins T、c.1106G>A、c.323G>A、c.2080C>T、c.1631G>A。结合文献报道,选择10个MUT基因热点突变位点进行检测,分别为:c.729730ins T、c.1106G>A、c.323G>A、c.1280G>A、c.1631G>A、c.424A>G、c.1741C>T、c.914T>C、c.1677-1G>A、c.2080C>T。根据以上位点设计特异性引物,在基因检测中,经2步PCR反应,捕获浓度为87.2-186ng/μL,均高于60ng/μL,平均捕获浓度160.14 ng/μL,捕获效果可。分析下机数据,各样本测序数据量为23.02-32.75Mb,平均29.55Mb。各位点4×覆盖度及20×覆盖度均为100%。每样本的平均测序深度12123.06×-17205.88×,平均13113.6×,测序深度远>100×,达质控标准。10例样本中,致病突变位点及正常样本检测准确,与获得的致病基因突变信息相符。结论:1.山东半岛甲基丙二酸血症最常见的致病基因为MMACHC基因,其次为MUT基因。2.山东半岛MMACHC基因最常见的突变位点为c.609G>A,其次为c.658660del AAG。本研究选择相对常见的突变位点8个,大约可涵盖90%左右的MMACHC基因突变位点。3.山东半岛MUT基因突变位点较为散在,无明显优势的热点突变位点。本研究选择相对常见的突变位点10个,大约可涵盖45-55%左右的MUT基因突变位点。4.本研究根据选择的甲基丙二酸血症热点基因及突变位点,开发多重PCR结合二代测序进行相关突变的检测的方法,通过10例样本进行基因检测,根据建库捕获数据及测序结果分析,由数据量、覆盖度、捕获效率等数据方面显示,本次实验测序结果较为理想。5.该检测方法具有高效、准确、低成本、实验周期短、结果分析工作量小等特点。本检测技术路线可用于山东半岛大规模人群甲基丙二酸血症致病基因携带率筛查。第二部分山东半岛甲基丙二酸血症致病基因携带者筛查及分析目的:甲基丙二酸血症是甲基丙二酰辅酶A变位酶缺陷及其辅酶钴胺素代谢障碍导致的我国最常见的有机酸血症,在我国有机酸代谢障碍的发病中占55-60%,这一水平明显高于亚洲其他国家的15%-40%。在山东,甲基丙二酸血症发病率为1/3220-1/3920,明显高于全球水平的1/25万-1/5万。以上提示甲基丙二酸血症在我地区高发。由于该病多数为常染色体隐性遗传病,本文推测疾病高发的原因与山东半岛甲基丙二酸血症致病基因在人群中的携带率高有关。本文旨在通过正常新生儿调查山东半岛甲基丙二酸血症热点基因突变的携带情况,提供山东半岛甲基丙二酸血症携带情况的首份分子流行病学资料,探讨疾病高发与致病基因携带率的关系,为阐释疾病高发提供理论依据。此外,部分患者无有效治疗药物,病死率高、预后差。而其他患者虽然对维生素B12治疗有效,未经早期诊治也可导致进行性脑损伤甚至猝死。推广携带者筛查不仅可在孕前期了解生育风险,指导生育决策,降低疾病发病率,还可能在新生儿期筛查出患者改善预后。本研究还拟探讨适合本地区特点的甲基丙二酸血症携带者筛查,提供甲基丙二酸血症的有效防控措施。方法:收集2016年-2018年在山东半岛行新生儿筛查的正常新生儿作为研究对象,筛查标本为直径大小为13mm的干血滤纸片。采用磁珠法提取干血滤纸片DNA,采用多重PCR联合二代测序技术进行基因检测,即通过DNA的文库一次PCR特异性位点扩增、二次PCR加入生物标签,进行文库构建。采用磁珠法对每步PCR捕获DNA产物进行纯化。建库完成后通过Qubit测定及琼脂凝胶电泳评估捕获效率。对质检合格的文库进行混合、稀释,然后进行文库定量,定量合格后按照标准上机步骤对富集文库进行序列读取和结果分析。采用统计软件SPSS20进行统计学分析,分析检测结果并统计阳性筛查位点信息。结果:共5006人完成甲基丙二酸血症热点突变基因携带者筛查。筛查基因为甲基丙二酸血症的热点基因,其中筛查的单纯型甲基丙二酸血症的热点基因为MUT基因,合并型甲基丙二酸血症的热点基因为MMACHC基因。检测的突变位点为18个,其中MMACHC基因8个,MUT基因10个。MMACHC基因的检测突变位点包括:c.609G>A、c.658660del AAG、c.80A>G、c.217C>T、c.567568ins T、c.482G>A、c.394C>T、c.315C>G。MUT基因的检测突变位点包括:c.729730ins T、c.1106G>A、c.323G>A、c.1280G>A、c.1631G>A、c.424A>G、c.1741C>T、c.914T>C、c.1677-1G>A、c.2080C>T。携带者筛查检测质控如下:测序碱基总数为50.33±96.78Mb;质控后的碱基数为47.52±92.33Mb;所有的样本18个位点都测到,目标区域碱基测序深度大于4x的比例、目标区域碱基测序深度大于10x的比例、目标区域碱基测序深大于20x的比例均为100%。每样本目标区域的平均测序深度为最低106×,最高57825×,总体平均测序深度为11096.70±7220.92×;针对18个筛查位点,5006个人中有125个人携带致病基因。其中每人携带1个热点位点突变,0人携带2个及以上热点位点突变。MMACHC基因筛查出携带者人数为109人,占87.2%;MUT筛查出携带者人数为16人,占12.8%。125个人中涉及到的突变位点有14个,其余4个突变未检测到有人携带。MMACHC筛选的全部热点突变位点均有检出;MUT检出突变位点为:c.1106G>A、c.323G>A、c.1677-1G>A、c.2080C>T、c.1631G>A、c.914T>C。MMACHC基因筛查的热点突变位点的总体携带率为1/46,最常见的突变位点为c.609G>A,占所有热点位点的38.53%;其次分别为c.482G>A和c.658660del AAG,分别占所有热点位点的16.51%、12.84%。MUT基因筛查的热点突变位点的总体携带率为1/313。其中c.1106G>A携带率为0.14%、c.323G>A携带率为0.08%、c.1677-1G>A携带率为0.04%、c.2080C>T携带率为0.02%、c.1631G>A携带率为0.02%、c.914T>C携带率为0.02%。其中c.1106G>A、c.323G>A相对常见。结论1.本研究筛查的5006例山东半岛正常新生儿中,针对18个筛查的热点突变位点,有125个人携带致病基因,热点突变筛查的携带率为1/40.05（2.5%）。其中cbl C型占87.2%;MUT基因突变占12.8%。2.MMACHC筛查的热点突变位点有109人携带,cbl C型热点突变携带率为1/46。109人中携带的突变位点覆盖选择的全部8个热点突变位点。最常见的突变位点为c.609G>A,占所有热点位点的38.53%;其次分别为c.482G>A和c.658660del AAG,分别占所有热点位点的16.51%、12.84%。由于筛查的仅为90%的MMACHC基因突变,推测cbl C型总体携带率为1/41。3.MUT基因热点突变位点,有16人携带,总体携带率为1/313。16人中检出MUT突变位点6个,分别为:c.1106G>A、c.323G>A、c.1677-1G>A、c.2080C>T、c.1631G>A、c.914T>C,其中c.1106G>A、c.323G>A相对常见。由于筛查的仅为45-55%的MUT基因突变,推测MUT致病基因的总体携带率为1/156。4.山东半岛甲基丙二酸血症热点致病基因携带率高,是导致甲基丙二酸血症在该地区发病率高的分子生物学基础。5.甲基丙二酸血症的携带者筛查应逐步在我地区开展以降低疾病发病率。