目的:视神经损伤是目前临床上重要的致盲性眼病之一,主要表现为患者视力急剧下降、视野异常、对光反射障碍等。据统计,视神经损伤后,近半数患者将永久失明[1]。如何在视神经损伤后促进神经细胞再生及恢复视功能是眼科临床和科研工作中的一个棘手问题。有病理学研究表明,视神经损伤后引起视力丧失的根源是视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的大量坏死以及神经轴突的退行性改变[2]。RGCs坏死及轴突再生受体内多种小分子共同调节,如神经营养因子、凋亡抑制因子缺乏,炎性因子表达上升等等。研究发现,睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)及神经调节蛋白-1(Neuregulin-1,NRG-1)在减少RGCs凋亡、抑制继发性炎症反应、促进轴突生长等神经保护方面作用显著。CNTF属于神经营养因子,可以通过抑制神经细胞凋亡、促进受损轴突再生等多种途径保护神经细胞。NRG-1是一种在细胞生长发育过程中起关键作用的小分子蛋白,可以通过抗凋亡、抑制炎症反应参与受损神经的保护过程。目前研究发现早期药物治疗可以保护视神经,改善视神经损伤患者的预后。临床上常用药物如抗氧化剂、激素等副作用大,治疗效果不明显。寻找一种安全有效且副作用小的治疗药物备受眼科同仁的关注。法舒地尔是一种Rho激酶(Rho-associated kinases,ROCK)抑制剂,为目前临床上常见的新型血管扩张剂。目前,法舒地尔在心脑血管系统疾病的疗效已被临床证实,其在抑制炎症、趋化细胞运动、促进神经细胞发育和分化等神经保护方面的作用也越来越受到广泛关注。但是目前关于法舒地尔神经保护作用的实验研究都集中在脑、脊髓损伤方面,而视神经保护方面的报道却很罕见。本次实验通过观察不同时间点不同组大鼠RGCs的数量及形态,并应用免疫组化及计算机图像分析技术对CNTF、NRG-1在视网膜内的表达进行半定量测定,探讨法舒地尔在视神经损伤后对RGCs的保护作用及对视网膜内CNTF、NRG-1表达的影响,为今后临床上视神经损伤的治疗提供新思路。方法:将60只雄性无眼病清洁级SD大鼠作为研究对象,体重(200±20)g。将其随机分三组,正常组12只、生理盐水组(对照组)24只、法舒地尔组(治疗组)24只。在对照组与实验组中建立右眼视神经不完全损伤模型,正常组双眼不做处理,对照组与治疗组均以右眼为模型。于建模1小时后每天一次,对照组腹腔注射10mg/kg生理盐水,治疗组腹腔注射法舒地尔10mg/kg,正常组不处理。在视神经损伤后3、7、14、21天时随机抽取正常组3只大鼠、对照组与治疗组6只大鼠,正常组大鼠取双侧眼球,对照组与实验组取大鼠右侧眼球制作视盘上方2mm处切片。HE染色后显微镜观察切片视网膜的损伤情况并计数RGCs数量,免疫组化染色后通过计算机图像分析技术检测视网膜平均光密度值(average optical density,AOD),观察视网膜内CNTF、NRG-1的表达情况,染色后计算机分析得出的AOD值代表抗原表达量,AOD值越高表示CNTF、NRG-1阳性表达越强。使用SPSS13.0软件包对原始数据进行统计学分析,本实验结果均为正态分布计量资料,统计结果使用均数±标准差表示。同时间点三组数据进行独立样本t检验,同一组不同时间点数据采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05有统计学意义。结果:1各组视网膜组织苏木精伊红(hematoxylin eosin,HE)染色后光镜观察1.1形态学改变正常组:RGCs呈圆形、椭圆形单层紧密排列,视网膜各层结构清晰,排列规整。各层细胞胞浆丰富,细胞核清晰可见,染色清楚。对照组:光镜下,损伤初期即可见神经节细胞层部分细胞水肿,中期可见RGCs排列松散,部分细胞出现空泡样改变,细胞数目也较早期降低,并伴随着出现细胞核固缩、裂解。视网膜各层排列均不规则并逐渐变薄。治疗组:各时间点视网膜均有不同程度的病理改变,但强于同时间段的对照组。1.2视网膜神经节细胞数量的改变采用×400的显微镜观察,各时间点正常组大鼠RGCs数量相比无差别(P>0.05);对照组各时间点平均RGCs数分别为18.114±1.159、12.093±1.205、6.866±1.188、3.408±1.464;治疗组分别为21.973±1.067、18.028±1.346、11.673±1.098、8.672±0.993。通过比对发现,视神经损伤后对照组与实验组RGCs数目均逐渐减少且各时间点RGCs计数均低于正常组(P<0.05)。各时间点对照组RGCs数均低于治疗组(P<0.05)。2视网膜CNTF、NRG-1免疫组化半定量检测2.1 CNTF在视网膜中的表达在正常组大鼠视网膜的神经节细胞层、双极细胞层、感光细胞层均可见到棕褐色染色的CNTF存在,其它各层也可见少量CNTF弥漫分布。视神经损伤3天后可见视网膜内CNTF表达增多。正常组3、7、14、21天视网膜CNTF的AOD分别为:0.126±0.004、0.125±0.017、0.129±0.006、0.128±0.039,各时间点无统计学差异(P>0.05);对照组视网膜CNTF的AOD分别为:0.231±0.016、0.319±0024、0.244±0.013、0.169±0.009;治疗组各时间点视网膜CNTF的AOD均高于对照组,为0.257±0.021、0.344±0.034、0.289±0.006、0.225±0.022。通过实验发现,对照组视网膜内CNTF在视神经损伤3天时表达增加,在7天达到顶峰后逐渐衰减,3-21天内各时间点CNTF表达均高于正常组(P<0.05)。治疗组各时间视网膜中CNTF阳性表达均强于对照组和正常组(P<0.05)。2.2 NRG-1在视网膜中的表达正常组大鼠视网膜内可见NRG-1少许表达,主要分布在视网膜神经节细胞层和双极细胞层,阳性反应细胞细胞核表现为棕黄色浓染。正常组3、7、14、21天视网膜NRG-1的AOD分别为0.117±0.014、0.121±0.015、0.119±0.020、0.124±0.027;对照组分别为:0.143±0.016、0.215±0.018、0.255±0.022、0.183±0.021;治疗组分别为:0.158±0.022、0.231±0.019、0.312±0.025、0.252±0.023。如上所示,视神经损伤三天时对照组NRG-1表达较正常组升高,在损伤14天达到峰值后逐渐减弱,21天时表达量仍明显高于正常组,3-21天对照组NRG-1表达量均高于正常组(P<0.05)。而治疗组中,各时间点视网膜内表达的NRG-1均高于正常组与对照组(P<0.05)。结论:1视神经损伤后RGCs数量减少,视网膜各层排列松散,腹腔注射法舒地尔后可以减轻RGCs损伤,减少细胞数目丢失,说明法舒地尔对损伤后的视神经具有保护作用。2视神经损伤后,对照组与治疗组各时间点视网膜CNTF的表达较正常组均有上升,说明CNTF参与了视神经损伤后神经保护和修复的过程。3视神经损伤后,对照组与治疗组各时间点视网膜NRG-1表达增加,说明NRG-1参与了视神经损伤后神经保护和修复的过程。4腹腔注射法舒地尔后,CNTF、NRG-1表达均较对照组高,表明法舒地尔可能通过上调视网膜内的CNTF以及NRG-1表达改善视神经损伤早期RGCs的损伤情况,保护视神经。